Teknologi til inaktivering og virusfjernelse af blodprodukter

Blodprodukter er "plasmaproteinkomponenter eller blodcellekomponenter, såsom humant blodalbumin, humant immunglobulin, human koagulationsfaktor (naturlig eller rekombinant) røde blodlegemekoncentrat osv., adskilt fra sundt humant plasma eller specifikt immunt humant plasma, renset eller fremstillet ved rekombinant DNA-teknologi til diagnose, terapi eller passiv immunprofylakse". Blodprodukter spiller en vigtig rolle i medicinsk nødsituation, redning af krigsskader og forebyggelse og behandling af nogle specifikke sygdomme.

 

Regulatorisk baggrund

Sikkerhedspraksis skal sikre, at det endelige lægemiddel er sikkert for regulatorer og i sidste ende for patienter og offentligheden. I 1990'erne udsendte den internationale koordinationskonference (ICH 1998) "Q5A: Viral Safety Assessment of Biotechnological products of Human or animal Origin Cell lines" (Q5A: Viral Safety Assessment), der etablerede en verdensomspændende standard for viral sikkerhed.

ICH Q5A beskriver en multi-tiered ordning for test og clearing validering for at nå dette mål. Testprogrammet fokuserer på cellebank, råmateriale og bioreaktorhøst, suppleret med produktrisikoanalyse. Ud over test kræver ICH Q5A, at nedstrøms dekontaminering vurderes som en fejlsikker foranstaltning, når der ikke detekteres forurenende stoffer opstrøms. Clearanceverifikation sikrer, at hvis en virus unddrager sig testregimet, kan den fjernes og/eller inaktiveres, før den ender i det endelige lægemiddel.

 

Baggrund for det overordnede virussikkerhedsprogram

I moderne bioteknologisk fremstilling (eller bioprocessing) er der normalt tre eller fire enhedsoperationer i hele den rensede sekvens, der er i stand til at fjerne eller inaktivere virussen. Dette inkluderer visse kromatografiske trin (såsom protein A eller anionbytning), dyrkning af lav pH eller detergenter og virusretentionsfiltre. Ikke alle disse trin vil effektivt fjerne eller inaktivere alle vira.

For eksempel er lav pH-kultur sædvanligvis ineffektiv til inaktivering af virus uden kappe, men den fungerer godt til inaktivering af kappevirus. Under visse driftsbetingelser er anionbytterkolonnen muligvis ikke i stand til at binde og fjerne neutrale isoelektriske vira fra produktstrømmen, men den er effektiv mod sure vira.

Det er en kombination af tre til fire uafhængige og ortogonale enhedsoperationer, der tilsammen sikrer bioteknologiske produkters virussikkerhed.

 

Det antages generelt, at et robust, effektivt og pålideligt behandlingstrin vil være i stand til at fjerne eller inaktivere et stort antal vira (typisk defineret som 4 log10 eller større, hvor logreduktionsværdien eller LRV beregnes som log10 af det samlede antal antal vira i input divideret med det samlede antal vira i output). LRV kan dog ikke bruges som et enkelt absolut mål for et trins effektivitet. Dataene kan være foreløbige. Det er let at modellere, relativt ufølsomt over for ændringer i procesforhold og effektivt mod en række vira (WHO 2004).

Viral filtrering er bredt anerkendt som et så kraftfuldt og effektivt procestrin og er en nøglekomponent i den overordnede strategi for at minimere risikoen for eksogene og endogene virale partikler under fremstillingen af ​​bioteknologiske produkter.

Virale filtre fungerer ofte gennem stærke, størrelsesbaserede tilbageholdelsesmekanismer. Baseret på denne kraftfulde virkningsmekanisme er det mere sandsynligt, at virale filtre end kromatografiske trin giver forudsigelig viral retention for en række vira. Dette skyldes, at filteret er mindre tilbøjeligt til at blive påvirket af forskelle i de fysisk-kemiske egenskaber af forskellige vira og virus-harpiks-interaktioner reguleret af driftsbetingelser. Derfor er det virale filtreringstrin almindeligt anvendt i veldesignede rekombinante terapeutiske proteinoprensningsprocesser (EMEA 1996), som også har vist sig at have robust ydeevne i plasmabehandlingsindustrien.

 

Blodprodukter er dog som et tveægget sværd, der ikke kun redder tusindvis af liv, men også har mulighed for at sprede sygdomme og udgøre en trussel mod menneskers sundhed. Ifølge statistikker modtog mindst 30,000 blodmodtagere i USA fra 1977 til 1984 blod inficeret med AIDS-virus. I 1985 blev 1.200 ud af 3000 blødere i Frankrig inficeret med AIDS gennem blodtransfusioner eller blodprodukter.

Ifølge Verdenssundhedsorganisationen er 5% til 10% af AIDS-infektioner på verdensplan forårsaget af transfusioner af AIDS-inficeret blod eller blodprodukter. Det første tilfælde af AIDS i Kina blev inficeret ved at bruge importerede blodprodukter inficeret med AIDS-virus. Derudover er der også rapporteret overførsel af hepatitis B- og C-sygdomme på grund af transfusion af blod og blodprodukter.

 

1. Vigtigste vira, der overføres af blodprodukter og deres egenskaber

Der er mange typer vira, der overføres gennem blod og blodprodukter, som vist i tabel 1. Blandt dem er HIV, HBV og HCV blevet bekymret af indenlandske og udenlandske lægekredse på grund af deres høje infektionsrate og alvorlige skader.

Fordi blod og blodprodukter har mulighed for at sprede vira, har det alvorligt påvirket dets anvendelse til forebyggelse og behandling af sygdomme. Derfor skal der ved produktion af blodprodukter tilføjes virusinaktiverings- og fjernelsesprocesser for at sikre blodprodukternes sikkerhed.

2. Vigtigste metoder til inaktivering og fjernelse af virus

For at sikre sikkerheden af ​​blodprodukter er inaktivering og fjernelse af virusbehandling af blodprodukter, ud over udvælgelse af bloddonorer, immunisering, hvor det er muligt, og streng test af indsamlet blod og andre foranstaltninger et vigtigt led for at sikre sikkerhed ved blodtransfusion. Flere almindeligt anvendte og effektive metoder til inaktivering og fjernelse af vira er beskrevet i detaljer nedenfor.

 

I. Virusinaktiveringsmetoder

1. Pasteur metode

Det teoretiske grundlag for denne metode er, at ødelæggelseshastigheden af ​​virusstrukturen er meget højere end proteinstrukturens gennem valg af temperatur og virkningstid. Næsten 50 års kliniske brugsresultater og nyere dyreforsøg har bekræftet, at albumin i opløsning efter 60 graders, 10 timers varmebehandling, det vil sige Pasteur-desinfektion, ikke kun kan inaktivere HBV, men også inaktivere HCV og HIV, hvilket gør albumin til den mest pålidelige blodprodukt i viral sikkerhed.

For nylig er Pasteurs proces blevet udvidet til produktion af IVIG, FVI, FIX, fibrinogen og andre produkter. Bridonnccu et al. tilføjede denne virusinaktiveringsproces til lavtemperatur-ethanolproduktion IVIG-processen, det vil sige, at Pasteur-metoden blev implementeret under betingelserne uden stabilisator, lavt saltindhold og surhedsgrad, og virustiteren faldt med 5 log. Simmonds et al. testede transfusionsoverført virus (TTV) af FVⅢ- og FIX-koncentrerede præparater, der er klinisk brugt i Storbritannien, og fandt, at TTV-detektionsraten for produkter uden Pasteur-virusinaktivering var 50 % til 75 %, og den positive detektionsrate af produkter efter Pasteur-inaktivering var 0.

Den TTV-positive rate var 27 % hos 84 hæmofilipatienter i Det Forenede Kongerige, som brugte ikke-inaktiverede koagulationsfaktorprodukter, mens kun 1 ud af 19 patienter, der brugte virus-inaktiverede koagulationsfaktorprodukter, var positive, med en positiv påvisningsrate på 5 %. Derfor er virusinaktiveringsprocessen meget effektiv til at forbedre sikkerheden af ​​blodprodukter.

 

2. Organisk opløsningsmiddel kombineret med overfladeaktivt stof (S/D-metode)

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90 %. Et stort antal blodprodukter, der er inaktiveret med S/D-metoden, har vist sig at være sikre og pålidelige gennem langvarig klinisk anvendelse, så de er meget udbredt. Denne metode har imidlertid ingen inaktiveringsevne mod parvovirus B19, HEV og andre ikke-lipo-coatede vira.

 

3. Tørvarmeinaktiveringsmetode

Tørvarmeinaktivering betyder, at det frysetørrede præparat behandles ved opvarmning, og virussen dræbes af tør varme. De almindeligt anvendte tørvarmemetoder er 60 grader ~80 grader, 10~72 timers opvarmningsmetode og 80 graders, 72 timers behandlingsmetode. Så tidligt som i begyndelsen af ​​1980'erne var det nyttigt at opvarme FVIII frysetørret koncentreret præparat og prothrombinkompleks ved 60 grader ~ 80 grader i 10 ~ 72 timer. Det er dog blevet bevist, at denne metode ikke fuldstændig kan inaktivere HBV, HCV, HIV. Tør varmebehandling ved 80 grader og 72 timer har vist sig at være effektiv til at inaktivere HBV, HCV og HIV. Der har også været nylige rapporter om frysetørrede præparater af koagulationsfaktorer behandlet ved 100 grader. Xu Jinbo et al. behandlede IgG ved 100 grader i 30 minutter og inaktiverede vesikulær stomatitisvirus 8,2 Log. Nogle mennesker vil fryse tørret FVIII ved 68 grader i 72 timer, i tør tilstand og derefter opvarmet til 100 grader i 0,5 ~ 1 time. Denne metode er relativt økonomisk.

 

4. Fotokemisk metode

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6,6 Log af celler bundet til HIV, og blodpladerne forblev gode efter 7 dages funktionel konservering in vitro, som er blevet godkendt af FDA til kliniske forsøg.

Blandt disse metoder er Pasteur-desinfektionsmetoden og S/D-metoden godkendt af USAs FDA og er meget udbredt i verden. Tørvarmeinaktiveringsmetoden er hovedsageligt egnet til virusinaktivering af frysetørrede præparater. Fotokemisk metode har en stærk inaktiveringseffekt på lipidovertrukne vira og er blevet brugt til inaktivering af hel plasmavirus i Europa og har brede udsigter til virusinaktivering i blodcellekomponenter. Men alle disse metoder har deres egne mangler, såsom Pasteur-sterilisering er ikke ideel til inaktivering af nogle varmeresistente vira; S/D-metoden kunne ikke effektivt inaktivere den ikke-lipo-coatede virus. Den fotokemiske metode beskadigede aktiviteten af ​​nogle plasmaproteiner betydeligt. Den nuværende kliniske brug af opfølgende undersøgelser viser, at ingen virusinaktiveringsmetode kan garantere, at blodprodukter er absolut fri for risikoen for overførsel af virus.

 

I. Virusfjernelsesproces

Ved produktion af blodprodukter kan én inaktiveringsproces ikke inaktivere alle vira; Derudover er virussen i sig selv et heterologt protein, såsom input med produktet vil fremkalde uønskede reaktioner; På samme tid, på grund af begrænsningen af ​​det tekniske niveau, er der stadig vira, hvis karakteristika ikke er fundet eller forstået, så de eksisterende virusinaktiveringsmetoder kan ikke garantere inaktiveringseffekten af ​​disse vira. Derfor kan inaktivering alene ikke garantere produktets sikkerhed og skal fjernes fra produktet. Så virusfjernelsesteknologi får mere og mere opmærksomhed. To almindeligt anvendte og effektive virusfjernelsesprocesser er kort beskrevet nedenfor.

1. Kromatografisk teknologi

Kromatografisk teknologi refererer til brugen af ​​forskellige komponenter og stationære faseaffinitets- eller interaktionsforskelle for at opnå adskillelse af forskellige komponenter. Som en avanceret teknologi til produktion af blodprodukter har kromatografi i sig selv den virkning at fjerne vira, især affinitetskromatografi og ionbytterkromatografi. Til ionbytterkromatografi har eluering fordele i forhold til indtrængning i virusfjernelse. Tabel 2 viser datastatistikken over HAV-fjernelseshastighed ved kromatografisk teknologi i processen med albuminproduktion af CSL Company i Australien. Som det kan ses af tabel 2, er ionbytterkromatografi og gelfiltrering mere effektive til at fjerne HAV med en total fjernelseshastighed på 10,9 log.

I produktionen af ​​FVIII udfører Baxter Healtheare immunoaffinitetskromatografi ved hjælp af anti-FVIII antistof-behandlede geler, som kan fjerne (4.2±0.1)Log og (5.3±0.9)Log fra ikke -lipidcoatede vira såsom henholdsvis PPV og HAV.

 

2. Nanofilmfiltrering

For nogle vira med lille overfladediameter, såsom HAV og parvovirus B19, er nanomembranfiltrering den mest effektive metode til fjernelse. Det udnytter størrelsesforskellen mellem proteiner og vira og adsorptionen af ​​vira af filtermembranen til at isolere vira. En laboratorieundersøgelse blev udført på Sanquin Blood Supply Site i Holland om fjernelse af vira ved at tilføje en et-trins, to-trins Planova 15N nanomembranfiltrering til protrombinkompleksproduktionsprocessen. Det viste sig, at fjernelseshastigheden for HIV, HAV og andre vira blev øget i varierende grad efter nanomembranfiltrering (se tabel 3).

Imidlertid kan følgende problemer opstå, når denne metode anvendes til industriel produktion: For det første, på grund af produktets høje viskositet og tilstedeværelsen af ​​proteiner med stor diameter, bør porestørrelsen af ​​membranen, der vælges af filteret, ikke være for lille, begrænser således fjernelsen af ​​vira med lille diameter, såsom HCV; For det andet vil stabiliteten af ​​membranporestørrelseskontrol i processen med filterproduktion påvirke fjernelse af virus. For det tredje, når membranåbningen, der er mindre end diameteren af ​​viruspartiklen, blokeres, vil produktflowhastigheden blive reduceret, hvilket påvirker udbyttet. Derfor er valget af membraner, hvis egenskaber og porestørrelse passer til de forarbejdede produkters behov, en vigtig faktor for, om nanomembranfiltreringen kan fjerne vira.

 

3. Diskussion

Under forudsætningen om at sikre kvaliteten af ​​blodkilden er processen med inaktivering og fjernelse af virus et vigtigt og nødvendigt middel til at sikre blodprodukternes sikkerhed. Brugen af ​​kun én inaktiveret virusproces kan ikke absolut garantere sikkerheden af ​​blodprodukter. På basis af virusinaktiveringsteknologien blev virusfjernelsesteknologien såsom kromatografi og nanofilmfiltrering tilføjet, virusfjernelseshastigheden blev kraftigt øget, og virusinaktiverings- og fjernelseseffekten blev væsentligt forbedret. På nuværende tidspunkt har Europa klart foreslået, at der i produktionsprocessen af ​​blodprodukter skal anvendes mindst én inaktivering og fjernelse af vira for at sikre blodprodukternes sikkerhed.

I Kina bruger de fleste producenter af blodprodukter kun én inaktiveret virusproces i produktionsprocessen, såsom Pasteur-desinfektionsmetode, S/D-metode osv., men bruger ikke virusfjernelsesprocessen, som alvorligt påvirker kvaliteten af ​​blodprodukter. Med Kinas tiltrædelse af WTO vil produktionsprocessen og kvalitetsstandarderne for indenlandske blodprodukter være på linje med verden, ellers kan det ikke garantere den eksisterende hjemmemarkedsandel, men kan heller ikke konkurrere med lignende produkter i andre lande i internationale marked.

Derfor skal Kinas producenter af blodprodukter forbedre produktionsprocessen, styrke inaktiveringen og fjernelsen af ​​virussen for fuldt ud at sikre produktets kvalitet og sikkerhed. Derfor vil det være tendensen for kinesiske producenter af blodprodukter at bruge kromatografi til at rense blodprodukter og fjerne vira for at sikre blodprodukternes sikkerhed.

 

Om Guidling

 

Guidling Technology er en national højteknologisk virksomhed med fokus på biofarmaceutiske produkter, cellekultur, oprensning og koncentration af biomedicin, diagnose og industrielle væsker. Vi har med succes udviklet centrifugalfilterenheder, ultrafiltrerings- og mikrofiltreringskassetter, virusfilter, TFF-system, dybdefilter, hule fibre osv., som fuldt ud opfylder anvendelsesscenarierne for biofarmaceutika, cellekultur og så videre. Vores membraner og membranfiltre bruges i vid udstrækning til koncentrering, ekstraktion og adskillelse af forfiltrering, mikrofiltrering, ultrafiltrering og nanofiltrering. Vores mange produktlinjer, fra små laboratoriefiltrering til engangsbrug til produktionsfiltreringssystemer, sterilitetstestning, fermentering, cellekultur og mere, opfylder behovene for test og produktion. Guidling Technology ser frem til at samarbejde med dig!