Fuld analyse af MRNA-lægemiddelfremstillingsprocessen: Hvordan TFF-teknologi løser oprensningsudfordringer

I de senere år har mRNA-teknologien opnået banebrydende fremskridt inden for det biofarmaceutiske område, hvilket viser et enormt anvendelsespotentiale, især inden for vacciner og genterapi. Den succesfulde udvikling af mRNA-vacciner har ikke kun givet nye løsninger til forebyggelse og kontrol af infektionssygdomme, men har også drevet fremskridt inden for cancerimmunterapi og personlig medicin. Som en ny klasse af terapeutiske produkter er stor-fremstilling af mRNA meget udfordrende, der involverer kontrol af RNA-stabilitet, fjernelse af resterende enzymer og reaktion fra-produkter, bufferudveksling og opnåelse af høje-renhedsgenvindingshastigheder, som alle kræver fremstillingsløsninger med regulatoriske{5}}godkendte teknologier.

Fremstillingsprocessen for mRNA-vacciner eller terapeutika er hovedsageligt opdelt i tre faser: fremstilling af plasmid-DNA-bulk-opløsning, fremstilling af mRNA-bulk-opløsning og fremstilling af mRNA-LNP-lægemiddelprodukt.

Flowchart for mRNA-lægemiddelfremstillingsproces

 

Tangential flow filtration (TFF), som en vel-etableret membranseparationsteknologi, anvendes i vid udstrækning i mRNA-fremstilling på grund af dens høje-effektive molekylære sigteevne, kontrollerbare bufferudveksling og lave forskydningsspændingsegenskaber. Baseret på membranmoduldesign omfatter almindelige TFF-konfigurationer flade-arkkassetter og hule-fibermoduler. Derudover kan tryk-dreven membranseparation i TFF klassificeres i mikrofiltrering (MF), ultrafiltrering (UF), nanofiltrering (NF) og omvendt osmose (RO) i henhold til membranporestørrelse med progressivt stigende selektivitet.

 

TFF spiller en kritisk rolle på tværs af flere stadier af mRNA-lægemiddelfremstilling, herunder fremstilling af plasmid-DNA-bulk, mRNA-bulkproduktion og den endelige formulering af mRNA-LNP-lægemiddelprodukter. Gennem passende valg af membrantype, molekylvægt cut-off (MWCO) og membranmateriale muliggør TFF effektiv fjernelse af reaktionsbiprodukter og lav-molekylære-urenheder, samtidig med at det letter bufferudveksling og koncentration både før og efter LNP-indkapsling. Dette forbedrer markant RNA-renhed, stabilitet og overordnet processkalerbarhed.

 

Ydeevnen af ​​tangentiel flowfiltrering påvirkes desuden af ​​systemkonfigurationsfaktorer såsom pumpetype og slangedesign, såvel som nøgleprocesparametre, herunder transmembrantryk (TMP), forskydningsspænding og filtreringsflux. Disse faktorer skal vælges omhyggeligt og optimeres baseret på målproduktets egenskaber, især for stress-følsomme produkter såsom mRNA-LNP, som er meget modtagelige for eksterne mekaniske kræfter under forarbejdning.

 

Oprensning af plasmid DNA

Fremstillingen af ​​plasmid-DNA-stamopløsning er grundlæggende baseret på sekvensdesignet af transkriptionsskabelonen. Fremstillingsmetoderne involverer typisk plasmid-DNA-amplifikation, selvom PCR-amplifikation også kan anvendes. Tager DNA-amplifikation som et eksempel, konstrueretE. colibruges almindeligvis til fermenteringsbaseret-forstærkning. Nedstrøms oprensningsprocessen omfatter hovedsageligt celleopsamling, lysering og klaring, koncentration og bufferudveksling, sterilfiltrering, linearisering og kromatografisk oprensning. I industrielle omgivelser bruges kontinuerlig-flow-centrifugering ofte til celleopsamling, men det genererer relativt høje forskydningskræfter. Hulfibersystemer er med deres åbne kanaler og lav forskydning mere velegnede til at håndtere prøver med højt faststofindhold, høj viskositet eller forskydningsfølsomhed, såsom plasmid-DNA. Efter opsamling udsættes cellerne for højtrykshomogenisering, ultralydbehandling eller alkalisk lysering efterfulgt af foreløbig klaring gennem dybdefiltrering.

 

For at lette efterfølgende kromatografi anvendes tangentiel flowfiltrering (TFF) ved hjælp af membrankassetter eller hulfibersøjler med molekylvægtsgrænser- på 30 kDa, 100 kDa eller 300 kDa ofte først til koncentration og bufferudveksling. Dette reducerer prøvevolumenet og fjerner samtidig nogle urenheder såsom RNA, værtscelleproteiner (HCP) og værtscelle-DNA-fragmenter (HCD). Kromatografi tjener som kerneoprensningstrinnet. Typisk kombineres anionbytterkromatografi (AEX) med hydrofob interaktionschromatografi (HIC) for effektivt at fjerne urenheder og berige meget bioaktivt supercoiled plasmid-DNA, hvorved plasmidets renhed forbedres væsentligt.

 

Efter oprensning udsættes plasmidet for TFF igen for at koncentrere opløsningen til målkoncentrationen (normalt 0,5-2 mg/ml) og for at udføre dialyse med den endelige opbevaringsbuffer. Dette trin fjerner resterende salte og organiske opløsningsmidler fra processen, hvilket sikrer, at buffersystemet opfylder kravene til nedstrøms in vitro transkriptions (IVT) reaktioner.

 

Oprensning af in vitro transskriberet (IVT) mRNA

In vitro-transkription (IVT) og modifikation er nøgleprocesserne til fremstilling af mRNA-stamopløsninger. Under IVT mRNA-produktion anvendes en kombination af tangentiel flowfiltrering (TFF1) - kromatografi - tangentiel flowfiltrering (TFF2). Denne strategi sikrer effektiv og-oprensning af mRNA af høj kvalitet, hvilket giver kritisk støtte til fremstilling af vaccine.

Efter at transkriptions- og modifikationsreaktionerne er afsluttet, udføres ultrafiltrering/diafiltrering ved hjælp af membrankassetter eller hulfibersøjler med molekylvægtsgrænser- på 30 kDa, 100 kDa eller 300 kDa typisk først. Dette trin fjerner effektivt forskellige proces-relaterede urenheder fra reaktionssystemet, såsom RNA-polymerase, resterende DNA-fragmenter, ureagerede NTP'er, capping-enzymer, dobbelt-strenget RNA (dsRNA) og små-molekylehæmmere, mens der samtidig opnås bufferudveksling. Efter et enkelt tangentielt flowfiltreringstrin fjernes de fleste urenheder effektivt, og den eneste påviselige resterende proteinurenhed er RNA-polymerase.

Efterfølgende anvendes multiple kromatografiteknikker til yderligere oprensning. Almindeligvis anvendte metoder omfatter affinitetskromatografi, størrelse-udelukkelseskromatografi, ion-omvendt-fasekromatografi og ion-udvekslingskromatografi. Gennem denne kombination af ultrafiltrering og sekventiel kromatografi opnår mRNA'et et højt niveau af renhed.

 

For at opfylde formulerings- eller opbevaringskravene koncentreres eller fortyndes mRNA-stamopløsningen igen under anvendelse af 30 kDa, 100 kDa eller 300 kDa membrankassetter eller hulfibersøjler for præcist at justere målkoncentrationen og udskiftning til den endelige formuleringsbuffer. Til sidst påføres steril-filtrering for at kontrollere mikrobiel belastning, hvilket afslutter den midlertidige opbevaring og påfyldning af materialet.

Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).

 

Oprensning af mRNA-LNP-formuleringer

Lipid nanopartikler (LNP'er) er i øjeblikket det mest omfattende undersøgte leveringssystem til mRNA-terapi. På nuværende tidspunkt er forskellige mRNA-LNP-formuleringer i forskellige stadier af præklinisk og klinisk udvikling. LNP'er er meget følsomme over for fremstillingsprocesser. Blandt de enhedsoperationer, der kræves til mRNA-LNP-produktion, udgør koncentration og bufferudveksling via tangentiel flowfiltrering (TFF) samt sterilfiltrering betydelige udfordringer. Disse trin skal omhyggeligt optimeres for at sikre processkalerbarhed og produktkvalitet, samtidig med at man undgår problemer som membrantilsmudsning og forkert filterbelastning.

 

Efter mRNA-indkapsling anvendes tangentiel flowfiltrering (TFF) til oprensning. Formålet med dette trin er at fjerne uindkapslet mRNA, frie polymerer eller lipidmaterialer, såvel som resterende opløsningsmidler fra mRNA og lipider. Da mRNA-LNP'er udviser begrænset stabilitet ved stuetemperatur, er optimering af downstream-processer, herunder TFF, afgørende for at opretholde produktkvaliteten.

Nøgle optimeringsretninger omfatter: passende indstilling af transmembrantrykket (TMP) og den tangentielle flowhastighed baseret på partikelstørrelsen og stabiliteten af ​​mRNA-LNP'er for at balancere filtreringseffektivitet og partikelstress; udvælgelse af membraner eller hulfibersøjler med passende molekylvægtsgrænser- (MWCO, f.eks. 100 kDa eller 300 kDa) for effektivt at fjerne frit mRNA, urenheder og udvekslingsbuffer, mens partikeladsorption eller beskadigelse minimeres; og optimering af koncentrations- og diafiltreringsvolumen for at sikre effektiv bufferudveksling til målformuleringen og kontrollere den endelige partikelkoncentration og dispersitet.

 

Derudover skal kritiske kvalitetsattributter (såsom partikelstørrelse, polydispersitetsindeks [PDI] og mRNA-indkapslingseffektivitet) overvåges nøje under processen, og parametrene skal justeres dynamisk baseret på-realtidsdata for at opnå stabil, skalerbar og effektiv oprensning og formulering af mRNA-LNP'er.

 

På grund af ustabiliteten af ​​mRNA-LNP'er og deres komponenter under terminale steriliseringsmetoder, bruges et 0,2 µm sterilt-filter typisk til at fjerne bakterier og andre mikrobielle kontaminanter.