Undersøgelse af anvendelsen af ​​dyb filtrering i produktionsprocessen af ​​mund- og klovsygevaccine

Forord - Hvad er mund- og klovsyge

I det 14. århundrede er der skriftlige optegnelser om lignende mund- og klovsyge i Europa. Mund- og klovsyge er en akut, febril, meget smitsom sygdom forårsaget af mund- og klovsygevirus.

De kliniske symptomer på voksne dyr omfatter: øget kropstemperatur, blærer og sår i munden, blærer og sår i hoven, og endda hovskallen, som forårsager problemer med at spise og sove, vægttab og endda tab af økonomisk værdi hos økonomiske dyr ;

De kliniske symptomer hos unge dyr omfatter: forhøjet kropstemperatur, myokarditis og andre symptomer, når de først opstår, har unge dyr en høj dødelighed.

 

Abstrakt

I løbet af de sidste 500 år er mund- og klovesyge gentagne gange brudt ud over hele verden, og et stort antal grise, kvæg, får og andre husdyr og vilde hovdyr med jævntå er døde eller blevet syge, hvilket har ramt husdyrene alvorligt. og avlsindustrien.

 

For at studere anvendelsen af ​​dybdefiltreringsteknologi i produktionsprocessen af ​​mund- og klovesygevaccine blev filtrerbarheden af ​​overfladefiltrering og dybdefiltrering testet og sammenlignet, såvel som den beskyttende effekt på bakteriedræbende filtrering. Fordelene ved højladt dybfiltrering ved fjernelse af cellerester blev undersøgt. De tilsvarende filtreringsskemaer for cellekulturmedium med forskellig turbiditet blev analyseret.

 

Resultaterne viste, at den dybe filtreringsbelastning var 13,9 gange den for overfladefiltreringen, at filtervæskens turbiditet kun var 23,5 % af overfladefiltreringen, og den efterfølgende 0.2um debakterialiseringsbelastning var 7,2 gange den for overfladefiltrering. Ved at bruge dens specielle harpiksligand er turbiditeten af ​​filtervæsken 38,6 % af den for det almindelige dybe filter med samme porestørrelse, hvilket er gavnligt for at beskytte nedstrømsprocessen. Resultaterne viste, at dyb filtrering, især dybfiltrering med stærk positiv ladning, effektivt kunne anvendes til fremstilling af MKS-vaccine, og passende filtreringsprocesser bør etableres for forskellige dyrkningsmedier.

 

Mund- og klovsyge og dyb filtrering

Mund- og klovsyge (FMD) er en akut, febril og smitsom sygdom hos klovdyr forårsaget af mund- og klovesygevirus (FMDV). De dyr, der er mest modtagelige for denne sygdom, omfatter kvæg, svin og får. Mund- og klovsyge er endemisk i Asien, Afrika, Mellemøsten og Sydamerika med en meget høj forekomst og hurtig overførsel. Verdensorganisationen for Dyresundhed (OIE) angiver det som den første kategori A zoonotisk sygdom, hvilket kræver, at medlemslandene medtager mund- og klovesyge på listen over anmeldelsespligtige dyresygdomme. Vaccination er et effektivt middel til specifik forebyggelse af MKS. MKS-inaktiveret vaccine, som er fremstillet ved at inaktivere intakt virus med inaktivator, spiller en vigtig rolle i forebyggelsen og bekæmpelsen af ​​MKS.

Antigeniciteten af ​​MMDV i sig selv er dårlig, og inaktiveringen af ​​virussen har stor indflydelse på dets antigen. Derfor kan højrenhed MKS-vaccine i den nuværende produktion af MKS-vaccine sikre antigenindholdet og renheden af ​​enhedsdosis, hvilket er særligt vigtigt og også er den nuværende vaccinationsstrategi. Dette stiller høje krav til nedstrøms oprensning af vira. Derudover har før 2009 opstrøms for inaktiverede mund- og klovesygevacciner i Kina for det meste vedtaget dyrkningsmetoden med at rotere flasken og klæbe til væggen. Med den stigende efterspørgsel efter vacciner opstod gradvist ulemperne ved denne dyrkningsmetode, der kræver et stort antal roterende flasker, lav effektivitet og lavt ekspressionsniveau.

Derfor har cellekulturteknologien i de senere år langsomt ændret sig fra den tidligere adhærente kultur til suspensionskultur, og virusproduktionen er blevet væsentligt forbedret. Men med stigningen i virusproduktionen har ændringen af ​​dyrkningsmåden bragt et større pres på nedstrøms oprensning, fordi celleaffaldet, der genereres af dyrkningsprocessen, cellefrigivelsen af ​​værtsproteiner, værts-DNA osv. er steget tilsvarende, hvilket stiller yderligere krav til nedstrøms rensningsevnen.

Membranfiltreringsteknologi er meget udbredt i produktionsprocessen af ​​biologiske produkter såsom vacciner, blandt hvilke DC-filtreringsteknologi normalt bruges i høstprocessen af ​​sygdomsgift for at adskille uopløselige urenheder såsom celleaffald. I den tidlige FMDV-afklaring blev overfladefiltreringsteknologien repræsenteret ved det foldemembranfilterelement hovedsageligt taget i brug. Med ændringen af ​​kulturbetingelserne, stigningen i celleaffaldsurenheder, er overfladefiltrering vanskelig at opnå klaringseffekten, og fordi overfladefiltreringsbelastningen er lav, bliver omkostningerne ved filtermaterialer højere og højere.

 

Under ovenstående baggrund er dyb filtrering blevet anvendt mere og mere i processen med cytovæskeseparation af FMDV. Det dybe filtermateriale er normalt sammensat af lange og fine fibre fra naturlige kilder, og den kanal, der dannes af filtermediet efter dannelse af en film, er ofte meget snoet, svarende til labyrintåbningsstrukturen. Urenhedspartikler er ofte fanget inde i filteret i stedet for på overfladen. Desuden absorberer filterkanalens væg ofte en del af ekstremt fine partikelurenheder ved elektrostatisk påvirkning eller intermolekylær kraft. Generelt er filtreringsmekanismen ved dyb filtrering karakteriseret ved mekanisk tilbageholdelse og adsorption.

 

Konstant strøm filtreringsmetode

Installer den dybe filterplade på konstantstrømsfilteranordningen, vask filterpladen med buffer PBS over 54 L/m2; Når vaskningen er færdig, startes den peristaltiske pumpe for langsomt at pumpe væsken, langsomt justere pumpehastigheden til omtrent den forventede strømningshastighed og filtrere væsken. Registrer filtreringsvolumen, tid, trykforskel og turbiditet under filtreringsprocessen. Filtratet blev opsamlet til antigenpåvisning.

 

Fordele ved dyb filtrering

Overfladefiltrering er en teknologi, der fanger partikler på overfladen af ​​filtermaterialet for at opnå filtrering. Filtreringsmekanismen er hovedsageligt baseret på størrelsen af ​​partikler i væskesien, store partikler fanges på overfladen af ​​filtermembranen. Dyb filtrering bruger interne kanaler til partikelopfangning og adsorption i dybden. Sammenligningsdiagrammet for de to er vist i figur 1.

Den inaktiverede opløsning af mund- og klovesygevaccine fra en bestemt producent blev forfiltreret med henholdsvis 0.45um polypropylenoverflademembran og dyb filterplade og derefter filtreret med 0.2um bakteriedræbende filter. Filtreringsdata er vist i tabel 1.

 

Turbiditeten af ​​den mund- og klovesygevaccine-inaktiverede opløsning er 77 NTU. Hvis bakterierne filtreres direkte, vil et stort antal cellefragmenter uundgåeligt forårsage, at 0.2um filtermembranen blokeres hurtigt, hvilket vil påvirke transmissionen af ​​146S vipartikler. Derfor blev præfiltrering designet før debakterialiseringsfiltrering, og de to præfiltreringsmetoder dybdefiltrering og overfladefiltrering blev sammenlignet. Den dobbeltlagede dybe filterplade er valgt til filtrering, belastningen er 641 L/m2, og dybfilteret reducerer materialet på 77 NTU til 9,65 NTU, hvilket er klart og lyst. Overfladefiltreringsbelastningen på 0.45um er kun 46 L/m2, og filtervæskens turbiditet er så høj som 41 NTU, hvilket ikke er egnet til forfiltrering. Ifølge sammenligningen af ​​den efterfølgende 0.2um debakterielle filtreringsbelastning er den debakterielle filtreringsmembranbelastning efter dyb filtrering 655 L/m2, hvilket er 7,2 gange af den tilsvarende overfladefiltreringsfiltreringsbelastning (kun 91 L/m2) .

146S testresultater viser, at udbyttet af dybt filtreringssystem er højere end udbyttet af overfladefiltreringssystem. Den dybe filtreringsbelastning var 13,9 gange overfladefiltreringens, turbiditeten af ​​filtervæsken var kun 23,5 % af overfladefiltreringen, og den efterfølgende 0.2um bakteriefjernende filtreringsbelastning var 7,2 gange den af overfladefiltrering. Derfor er dybfiltreringssystemet, både ud fra et omkostningssynspunkt og ud fra et udbyttesynspunkt, væsentligt bedre end overflademembranfiltreringssystemet.

 

Fordele ved stærk positiv ladning dybt filter

Den positive ladede dyb filterplade og den stærke positive ladde dyb filterplade blev brugt til at sammenligne den inaktiverede opløsning af mund- og klovesygevaccine fra forskellige kilder. Filtreringsresultaterne er vist i tabel 2, og ændringen af ​​filtreringshastighed og trykforskel i filtreringsprocessen er vist i farvelayout 2.

De to anvendte grupper af dybe filterplader har den samme blændenøjagtighed, og ydeevnen er meget konsistent med hensyn til belastnings- og trykforskelændringer, og trykforskelændringskurven i figur 2 er grundlæggende identisk.

 

Men fra filtervæskens turbiditet er forskellen meget stor. Filtervæsken på den almindelige positivt ladede dobbeltlags filterplade er 25 NTU, mens filtervæsken i den stærkt positivt ladede dyblagsfilterplade med samme åbning kun er 9,65 NTU, hvilket kun er 38,6 % af den almindelige dybe filterplade. Dette skyldes hovedsageligt den specielle harpiksligand i det stærkt positive ladede dybe filterpladefiltermateriale. Turbiditeten reduceres til mindre end 10NTU af den stærkt positive dobbeltlagsfilterplade, og cellefragmenterne adsorberes eller fanges fuldstændigt, hvilket er befordrende for den efterfølgende ultrafiltrerings- eller bakteriedræbende filtreringsproces. Ud over adsorptionseffekten på uopløseligt celleaffald har Yigzaw Y et al også rapporteret fjernelseseffekten af ​​stærkt positivt ladet dyb filterplade på celleværtsprotein, og Dorsey N et al har rapporteret fjernelseseffekten af ​​stærkt positivt ladet dyb filterplade på DNA.

 

Etablering af klaringsfiltreringsproces for supernatanten af ​​mund- og klovesygevaccine ved dybfiltrering

Gennem ovenstående sammenlignende undersøgelse af overfladefiltrering og dybdefiltrering og undersøgelsen af ​​klaringseffekten af ​​den specielle stærk positiv ladning dyb filterplade, bør forskellige filtreringsskemaer matches til den inaktiverede supernatant af mund- og klovesygevaccine produceret under forskellige kulturforhold. For centrifugalsupernatant med 3 forskellige turbiditet, lav turbiditet, medium turbiditet og høj turbiditet er dybfiltreringsskemaet og tilsvarende filtreringsparametre vist i tabel 3.

For den centrifugale supernatant med lav turbiditet kan den dybe enkeltlags filterplade effektivt klare og fjerne en lille mængde cellerester. For den centrifugale supernatant med medium turbiditet kan den dobbeltlagede dybe filterplade effektivt afklare, især den stærke positive ladning dyb filterplade kan reducere turbiditeten til mindre end 5 NTU; For centrifugal supernatant med højere turbiditet kan den kombinerede filterplade effektivt klares. Uanset hvilken proces, er behandlingskapaciteten 500 ~ 800 L/m2, filtervæskens turbiditet er mindre end 20 NTU, og målantigenet er fuldt genvundet, velegnet til produktion i stor skala.

 

Diskussion

I 1970'erne blev filtermediet specificeret til ikke at bruge asbestmaterialer på grund af tilstedeværelsen af ​​kræftfremkaldende stoffer i asbestmaterialer. Det dybe filtermateriale indeholder ikke asbest og har en stærkere positiv ladning. Filtermaterialet er lavet af træfibermatrix og filterhjælp. I produktionsprocessen bruges polymerharpiks til at forbinde de grundlæggende komponenter, og de positive ladningsfunktionelle grupper i den giver effektivt ladningsadsorptionsevnen af ​​det dybe filtermateriale. Den fremragende ydeevne af adsorptiv dyb filtrering på fine partiklers indfangningsevne er vist i figur 3.

I dette eksperiment blev forskellige harpikskomponenter og forskellige præcisions dybe filtermaterialer udvalgt for at afklare filtreringstesten af ​​FMDV-kulturopløsning, og sammenligningstesten blev udført med overfladefiltrering. Resultaterne viste, at dyb filtrering var mere egnet til fjernelse af cellerester end overfladefiltrering, hvilket var befordrende for den efterfølgende mikrobielle belastningskontrolfiltreringsenhed (0.2um). Ved at sammenligne filtreringseffekten af ​​den stærkt positive ladde dyb filterplade og den almindelige positiv ladde dyb filterplade viser den stærkt positive ladde filterplade en stærk turbiditetskontrolevne, som kan reducere turbiditeten til mindre end 5 NTU, hvilket er meget befordrende for at forbedre robustheden af ​​hele filtreringsprocessen.

Opstrømsdyrkningsprocessen har stor indflydelse på høsttrinene for aktive ingredienser. Gennem afprøvning etablerede dette eksperiment endelig et skalerbart filtreringsskema for cellekulturmedier med forskellig turbiditet, hvilket har en vis vejledende betydning for produktion i stor skala.

Dybdefilteret, der skal lanceres af Guidling Technology, er et filterelement af skivetypen, som er et slags effektivt filterelement med dybt filterkarton som filtermateriale, der fuldt ud opfylder de lovmæssige krav til biofarmaceutisk, hovedsagelig designet og fremstillet specifikt til fjernelse af stort faststofindhold, såsom celler og cellefragmenter, og kan påføres pattedyrcellekulturvæske; Afklaring af lysat af bakterier og gærceller; Fjernelse af værtscelleprotein (HCP); Fjern virus og DN; Fjernelse af endotoksiner; Fjernelse af skumdæmper.

Produktet har fordelene ved lille dødvolumen, lineær forstærkning, diskkapselstruktur, kompakt strukturdesign og kan bruges i serie med andet udstyr, lille fodaftryk, stabil flowhastighed, lang levetid og lave omkostninger.