Undersøgelse af virusopfangende evne af monoklonale antistoffer downstream proces

Bioteknologiske produkter afledt af cellelinjer kan være i risiko for viruskontaminering - omfanget afhænger af en række faktorer, herunder præparatkilden, de anvendte råmaterialer, produktionssystemet, rensningsreagenser og hjælpestoffer. At studere fjernelse eller inaktivering af vira i fremstillingsprocessen er et nøgletrin i at reducere potentialet for iatrogen overførsel af patogene vira og dermed reducere risikoen, som er afgørende for produkternes sikkerhed. Før biologiske produkter kan indgå i kliniske forsøg og markedsføres, skal deres fremstillingsproces påvises at have evnen til at fjerne kendte og formodede vira.

 

01 Monoklonalt antistofprodukt virus sikkerhedsvurdering

Forskningen i virusfjernelsesevnen er normalt ved at tilføje den kendte titerindikatorvirus til mellemproduktet på forskellige produktionsstadier, derefter bestemme restvirustiteren i prøven behandlet ved en specifik proces og til sidst evaluere logreduktionsværdien (LRV) af virustiteren. Procestrin for LRV Større end eller lig med 4log10 anses generelt for at være effektive virusfjernelsestrin. Processen med LRV<41og10 can be considered as helpful to increase the total virus clearance in the production process. However, due to the limitations of virus verification, the process with LRV≤11og10 has little significance for virus removal, and its LRV value is not included in the total amount of the production process.

Ved brug af metoden med simuleret produktionsproces (reduceret proces), er det nødvendigt at designe en rimelig virusfjernelse/inaktiveringsforskning og testplan relateret til den faktiske produktionsproces så vidt muligt, især de effektive produktionsprocestrin. Den simulerede proces skal være strengt konsistent med den faktiske proces med hensyn til testparametre og kontrolbetingelser.

 

02 Angiver almindeligvis vira og verifikationsordninger

Almindelige indikatorvirus er vist i tabel 1.

På det nye lægemiddelanvendelsesstadium (IND) kræver et bioteknologisk produkt virale clearance-undersøgelser for mindst 2 modelvirus, typisk udvælgelse af et retrovirus (X-MuLV) og et parvovirus (MMV). Under ansøgningsfasen for biologisk licens (BLA) udføres virusfjernelsesundersøgelser typisk ved hjælp af 3-5 specifikke/ikke-specifikke vira, og 3-5 procestrin evalueres for at påvise, at produktet har en tilstrækkelig sikkerhedsfaktor fra en virussikkerhedsperspektiv. På grund af forskellige retningslinjer i ind- og udland er der nogle forskelle i de trin til verifikation af virusrydning, der bruges til erklæringer. De almindeligt anvendte virusclearance-verifikationsskemaer i mAb-produktionsprocessen er vist i tabel 2.

 

03 Mulighed for virusfjernelse af downstream-processer

3.1 Nedstrømsprocessers evne til at fjerne forskellige vira

Fra 2009 indsendte monoklonale antistofprodukter til FDA for IND og BLA, protein A affinitetskromatografi, lav pH, anionbytterkromatografi AEX (flow penetration mode), kationbytter kromatografi CEX (binding - elueringstilstand) og virusclearance validering ekskl. virusfiltrering er de mest almindeligt anvendte indikatorvirusfamilier, og middelværdien og rækkevidden af ​​deres clearance-effekter er vist i Figur 1.

For retrovira, med undtagelse af CEX, som har en LRV på ca. 3log10 (som vist i A-søjlediagrammet i figur 1), var de andre processer robuste (LRV større end eller lig med 4log10). Herpesvirus og retrovira har lignende clearance-effekter og LRV > 4log10 (som vist i B-søjlediagrammet i figur 1). Små uindkapslede vira, såsom parvovirus, er sværere at fjerne effektivt, er modstandsdygtige over for kemisk behandling og fanges ikke let af filtre (vist i C-søjlediagrammet i figur 1). Kun AEX og små virusfiltre var effektive til at fjerne parvoviridae (gennemsnitlig LRV > 4log10).

Processerne vist i figur 1 er ProteinA, AEX (flow penetration mode), CEX (concomitation-elution mode), lav pH-inaktivering ("ufuldstændig "versus" fuldstændig "fjernelse) og devirusfiltrering med stor og lille åbning.

 

3.2 Påvirkningsfaktorer af downstream-processer på virusfjernelsesevne

Fordelingen af ​​LRV-værdier for hver proces er vist i figur 2. Studierne med 0 ~ 21og10 blev klassificeret som lav LRV-gruppe, og dem med mere end 6log10 blev klassificeret som høj LRV-gruppe til sammenlignende analyse.

 

3.2.1 ProteinA-affinitetskromatografi

Der var ingen signifikant korrelation mellem LRV-værdien af ​​Protein A-processen og balance/vaskebuffer, fyldstof, eluentsammensætning og eluerings-pH-værdi. Fællesnævneren for lav LRV-gruppen er, at råmaterialet er ret komplekst, og det kan være, at den komplekse vekselvirkning mellem råmateriale og fyldstof negativt påvirker den kromatografiske kolonnes evne til at fjerne vira.

 

3.2.2 AEX (gennemstrømningstilstand)

Strauss et al. viste, at pH og ledningsevne af AEX prøver kan påvirke LRV. Men de statistiske resultater fra Miesegaes et al viste, at i lighed med ProteinA havde LRV af AEX (flow penetration mode) ingen signifikant korrelation med forskellige buffere, fyldstoffer, pH og ledningsevne, hvilket kan skyldes optimering af pH og ledningsevne. i de indberettede sagsforløbsforhold.

 

3.2.3 CEX(Binding - Elueringstilstand)

Virusfjernelse ved CEX-processen er ikke robust nok. Der var ingen signifikant korrelation mellem LRV i gruppen med høj LRV og buffer, erfaringsniveau eller nogen kromatografiske søjleegenskaber, såsom søjlehøjde og harpikstype. Imidlertid var ligevægts-/belastnings- og eluerings-pH-værdierne anvendt i høj-LRV-undersøgelsen begge lavere, ved 5,3±0.2; I gruppen med lav LRV var pH 6.0±0,2. En anden faktor er, at saltkoncentrationen i bufferen også kan forårsage LRV-værdiforskellen. Bufferen anvendt i lav-LRV-undersøgelsen havde en højere saltkoncentration med en gennemsnitlig koncentration på 290±120 mM i loading/balanceringsopløsningen og 340±70 mM i eluenten, mens koncentrationerne af NaCl i høj-LRV-undersøgelsen var 58 hhv. ±27 mM og 183±31 mM.

 

3.2.4 Lav pH-inaktivering

I lav pH-processen er pH en nøgleprocesparameter, og en pH-værdi på 3,8 er tilstrækkelig til at inaktivere retrovirussen i grad. Gruppen med lav LRV havde en pH på 3,9, mens undersøgelsen med høj LRV havde en pH på 3,4.

 

3.2.5 Fjernelse af virusfiltrering

For både små og store blændefiltre var LRV-værdien for MuLV-fjernelse ikke mindre end 2log10, og kun 1% af undersøgelserne var under 3log10 (vist i h- og i-kolonnerne i figur 2). Den samlede clearance af retrovira med virusfiltre med stor åbning var lavere end den med virusfiltre med lille åbning (som vist i C-søjlediagrammet i figur 1). Hovedårsagen, der påvirker resultatet af parvovirusfjernelse, er de forskellige filtertyper. Generelt kan antivirusfiltrering pålideligt fjerne vira.

Processerne er Protein A(a), AEX-penetrationstilstand (b), CEX-binding - elueringstilstand (c), AEX-binding Ⅰ elueringstilstand (d), lav pH-inaktivering ("ufuldstændig "og" fuldstændig "clearance)(e ~ g), og stor porestørrelse (h) og lille porestørrelse (i ~ j) devirusfiltrering (hvor, a ~ i: Retrovirus; j: Parvovirus).

 

04 Innovationer og udfordringer i virussikkerhedsvurdering

Den kontinuerlige udvikling og innovation inden for downstream biofarmaceutiske processer vil uundgåeligt medføre innovationer inden for virusclearance-vurdering. Fremskridt i upstream- og downstream-processer - såsom kontinuerlige stream-bioprocesser - har gjort det nødvendigt at vurdere og etablere effektive og robuste virusfjernelsesprocesser. Under kontinuerlig flow forventes trin som virusinaktivering og virusfiltrering stadig at blive udført i batch-tilstand. Selvom virusfjernelsesevnen for kromatografiske processer i kontinuerlig flow-tilstand ikke bør være væsentligt anderledes end batchbehandling, skal den understøttes af data.

 

05 Udsigter

Fra et virologisk sikkerhedsperspektiv kan den biofarmaceutiske industris fremragende sikkerhed i vid udstrækning tilskrives industriens strenge overholdelse af tre nøglestrategier for viral sikkerhed: tilstrækkelig sourcing og testning af materiale- og cellebankkilder, dokumentering af viral clearance-vurderinger (virusvalideringsundersøgelser) og igangværende viral testning. Karakteristikaene for biologiske lægemidler produceret af nye cellesubstrater kan ændre sig med forskellige risici, og der kræves gode risikostyringsstrategier for at sikre sikkerheden af ​​biologiske lægemidler. Guidling Technology har erfarent professionelt teknisk team, der dækker filtreringsprocessen fra små forsøg, pilotforsøg til produktion i stor skala, vores membran- og membranfiltre bruges i vid udstrækning inden for forfiltrering, mikrofiltrering, ultrafiltrering, nanofiltreringskoncentration, ekstraktion og separation; Vores mange produktlinjer, fra små laboratoriefiltrering til engangsbrug til produktionsorienterede filtreringssystemer, sterilitetstest, fermentering, cellekultur med mere sikrer øget produktivitet.

Jiuling for at sikre produktkvalitet som den første indikator, i forfølgelsen af ​​"reducere omkostningerne, øge effektiviteten" på vejen til at udforske, ser frem til at arbejde sammen med dig i fremtiden for at imødegå udfordringerne i industrien og søge bedre udvikling.