Viruslignende partikelvaccine og dens nedstrømsoprensningsproces

Viruslignende partikel (VLP) -vaccine er en vaccineteknologi, der er baseret på virusstrukturen, men ikke indeholder de virale genetiske materialer. De stimulerer en stærk immunrespons ved at efterligne morfologien og overfladeantigenerne af naturlige vira og giver større sikkerhed på grund af deres manglende evne til at replikere. VLP -vacciner er et bedre alternativ til traditionelle vacciner (levende svækket og inaktiveret). VLP -vaccine kan ikke replikere i kroppen, så den er velegnet til alle, inklusive gravide kvinder eller dem med kompromitterede immunsystemer. Derudover kan kapsidproteiner (inklusive andre strukturelle proteiner) fra vira med segmenterede genomer, såsom influenzavirus, afrikanske hestesygevirus og Bluetongue -vira, også bruges til at udvikle VLP -vacciner uden at bekymre sig om genetiske rekombinationsproblemer som svækkede levende vacciner. For det andet er VLP'er i stand til at efterligne strukturen af ​​reelle vira, i modsætning til inaktiverede vacciner, hvis strukturelle proteiner kan modificeres under inaktivering, hvilket resulterer i immunogen svækkelse.

 

Fig. 1. dannelse af VLP'er og kimære VLP'er

 

Funktioner af VLP -vaccine

1. struktur svarende til naturlige vira: VLP'er er selvmonteret af virale et eller flere strukturelle proteiner (såsom kapsidproteiner), og deres størrelse og form ligner reelle vira.

2. ikke-infektiøst: indeholder ikke det virale genom, kan ikke replikere eller forårsage sygdom.

3. høj immunogenicitet: Granulær struktur kan genkendes af immunsystemet effektivt og aktivere B -celle- og T -celle -responser. Kan inducere neutraliserende antistoffer og cellulær immunitet (f.eks. HIV, HPV -vacciner).

4. Høj sikkerhed: Velegnet til mennesker med lav immunfunktion (såsom hepatitis B VLP -vaccine).

 

Fig. 2. Tilgængelige VLP -vacciner

 

VLP -vaccineproduktionssystem

VLP'er kan produceres gennem en række ekspressionssystemer, fælles platforme inkluderer:

 

1. insektcellebaculovirus-system:

Fordele: Højt udbytte, lave omkostninger, egnet til kompleks proteinsamling.

Anvendelse: HPV -vaccine, ebola -vaccine.

 

2. pattedyrceller (f.eks. HEK293 -celler):

Fordele: Efter-translationelle ændringer er tættere på mennesker og egnet til indhyllede VLP'er (såsom influenzavacciner).

 

3. gærsystemer (f.eks. Pichia pastoris):

Fordele: Hurtige, lave omkostninger er blevet brugt i hepatitis B -vaccine.

 

4. plantesystemer (f.eks. Tobakskloroplaster):

Miljøvenlig og skalerbar under udvikling (f.eks. Norovirus VLP -vaccine).

 

Nedstrøms oprensningsproces for VLP -vaccine

Mangfoldigheden af ​​VLPS -ekspressionssystemer fører til ineuniversaliteten af ​​nedstrømsoprensningsprocesser.

 

 

Fig. 3 Et generelt nedstrøms processtrømskort

 

Høst og afklaring:

I alle slags kulturmedium, der er propducering af cellekultur, er der et stort antal viruspartikler, såvel som mange cellevævsaffald, metaboliske produkter og andre urenheder, hvilket gør kulturmedium overskyet eller semi-sky, hvis koncentrationen af ​​kulturmediet direkte, er ultrafiltreringsmembranen blokeret, resultatet, at koncentrationen ikke kan afsluttes og ultrafiltreringsmembanen er skrab. Derfor skal det først afklares før koncentration for at fjerne de store partikler i kulturmediet, så det bliver en gennemskinnelig eller gennemsigtig opløsning, og koncentrationen af ​​kulturmediet kan gøre koncentrationsprocessen normal og sikre, at ultrafiltreringsmembranen leverer. Afklaring inden koncentration af kulturopløsning er et vigtigt teknisk led i koncentrationsprocessen.

 

En effektiv afklaringsproces kræver en kombination af høj kapacitet til at fjerne faste partikler, højt produktudbytte, let opskalering og beskyttelse til nedstrøms driftsenheder.

 

Metode

Centrifugering: Differentialcentrifugering fjerner store partikler.

Dyb filtrering: Brug et multistagesfilter (f.eks. 1,2 μm → 0. 45μm) for at afklare supernatanten.

Tangential Flow Filtration (TFF): Velegnet til masseproduktion, koncentrerer prøver og fjerner små partikler af urenheder.

 

Men hvis dyrkningsskalaen er for stor, tager centrifugering lang tid, vil der kræves et stort antal dybe filtermembraner, så omkostningerne ved forbrugsstoffer stiger meget. På samme tid vil den høje tæthed af cellekultur reducere belastningen af ​​den dybe filtermembran, hvilket resulterer i øgede omkostninger og overdreven produktfortynding.

 

Der er to slags TFF -membrankomponenter: flad kassette og hulfiber. Tangential flowfiltrering (TFF) drives af transmembrane trykforskellen. Stoffer og urenheder, der er mindre end membranporen, passerer gennem membranen, mens urenheder såsom celler med større partikler er fanget. Porestørrelsen af ​​den membran, der bruges til mikrofiltrering, er {{0}}. 45/0,22μm. Hollowfiber kan behandle væske med højt fast indhold direkte, såsom cellekulturmedium med høj densitet, det kan eliminere centrifugering og præ-filtreringstrin, færre trin, enkel drift, membran kan bruges gentagne gange gennem rengøring, reduktion af udstyrsinvesteringer og driftsomkostninger i overensstemmelse med kravene til modulær automatiseret produktion.

 

Ultrafiltrationskoncentration (TFF):

Mål: For at reducere mængden af ​​kromatografisk behandling skal du forbedre den kromatografiske effektivitet og beskytte den kromatografiske søjle.

Generelt kan ultrafiltrering (TFF) koncentrere sig mere end 100 gange VLP, og fjernelseshastigheden for heteroprotein kan nå 99%. Blandt dem har hule fibermembranfiltreringsteknologi fordelene ved mild og lav forskydningsstyrke, ikke let at tilslutte, fleksibel drift, lang levetid, lave omkostninger og let forstærkning, så det anbefales at vælge hulfiber til koncentreret og oprenset VLP.

 

Når ultrafiltreringsmetode bruges til koncentration og oprensning, er det meget vigtigt at vælge den rigtige membranporestørrelse, der bestemmer effektiviteten og kvaliteten af ​​koncentrationen direkte. På den ene side er det nødvendigt at vælge membranåbningen for effektivt at fange målmolekylerne for at sikre udbyttet, og på den anden side bør fjernelseseffekten og behandlingshastigheden af ​​heteroproteiner overvejes fuldt ud. Derfor er det bedste princip at vælge membranen med den største porestørrelse, der kan fange målmolekylet, og forsøge at vælge filtermembranen med ensartet porestørrelsesfordeling.

 

Primær rensning:

1. nedbørsmetode

Polyethylenglycol (PEG) nedbør: Selektiv nedbør af VLP'er kræver optimeret PEG -koncentration og saltkoncentration for at balancere udbytte og renhed.

 

2. kromatografi

Affinitetskromatografi:

Heparinaffinitet: Brug af VLPS -egenskaber ved overflade negativ ladning (f.eks. HPV VLP).

Antistofkoblingskromatografi: Høj specificitet, men dyrt.

Ion Exchange Chromatography (IEX): Vælg Anion Exchange (f.eks. Q -søjle) eller kationudveksling (f.eks. SP -søjle) afhængigt af VLP -overfladeladningskarakteristika, og optimer pH og saltgradient for at undgå partikelaggregering.

Hydrofob interaktionskromatografi (HIC): Baseret på VLPS-overfladehydrofobicitet, der er egnet til nogle ikke-indkapslede VLP'er.

 

Fin rensning:

Molekylær ekskluderingskromatografi (SEC, gelfiltrering):

Fjernelse af resterende værtsproteiner, nukleinsyrer eller aggregater, ledsaget af bufferudskiftning. Høj opløsning, men lav flux, der ofte bruges som det endelige forfiningstrin.

 

Multi-mode kromatografi:

F.eks. Kan Capto Core Series -harpikser kombineret med ionudveksling og molekylær sigteffekt fjerne en række urenheder i et trin.

 

Virusinaktivering/nukleinsyrefjernelse (hvis nødvendigt):

Nuklease -behandlinger: såsom benzonase nedbryder værts -DNA/RNA.

UF/DF: Koordinering af TFF -system for at fjerne små fragmenter af nukleinsyrer og enzymer.

 

Koncentration og forberedelse:

Tangential flow filtrering (TFF):

Koncentrer dig til måltitere, mens de fortrænger buffere (såsom PBS eller formuleringsbuffere).

 

Steril filtrering:

0. 22μm membranfiltrering sikrer sterilitet.

 

Typisk sag

Følgende er nedstrømsoprensningsprocesserne for typiske VLP -vacciner.

 

 

Om guidling

Guidling-teknologi er en produktionsorienteret og højteknologisk virksomhed med fokus på nedstrøms afklaring, adskillelse og oprensning af biofarmaceutiske stoffer. Produkterne er vidt brugt i filtreringsprocessen for mAb, vaccine, diagnose, blodprodukter, serum, endotoksin og andre biologiske produkter; Guidling -teknologi har "Cassettes Filter and Tangential Flow Filtration Device", "Hollow Fiber Membrane", "Virus Filter", "Deep Membrane", "Sterilizaation Filter", "Centrifugal Filter Devices" og andre produkter og har et stort antal produktlinjer, fra små disponible laboratoriefiltrering til produktionsfiltreringssystem, imødekommer behovene i test og produktion. Guidling -teknologi ser frem til at samarbejde med dig!