Nedstrøms ultrafiltrerings-/diafiltrerings-koncentrationsproces: Hvordan man effektivt forhindrer målproteingennemtrængning og -tab

Nedstrøms ultrafiltrerings-/diafiltreringskoncentrationsproces: Hvordan man effektivt forhindrer målproteingennemtrængning og tab

I nedstrøms oprensningsprocesser for rekombinante proteiner, blodprodukter og andre biologiske stoffer bruges ultrafiltrering/diafiltrering (UF/DF) til råstofkoncentration, bufferudveksling og fjernelse af salte og små-molekyleurenheder. Separation opnås baseret på membransigtning: Store molekyler såsom monoklonale antistoffer (mAbs) tilbageholdes af membranen, mens salte, endotoksiner, frie værtscelleproteiner (HCP'er) og andre små-molekyleurenheder passerer gennem membranen og fjernes i permeatet. Under procesopskalering- kan målproteintab gennem membranen let forekomme, hvilket direkte reducerer udbyttet og øger batchomkostningerne. Under nogle driftsbetingelser kan protein detekteres i permeatet, hvilket kræver hurtig bestemmelse af, om de lækkede komponenter er intakt mål-mAb, nedbrudte/fragmenterede aggregater eller værtscelleproteiner. Denne artikel er opdelt i to hoveddele: Den gennemgår traditionelle proces-kontroltilgange og etablerer i kombination med Design of Experiments (DOE) et robust procesvindue, understøttet af flere analytiske metoder til at bestemme identiteten af ​​proteiner, der er påvist i permeatet.

 

 

I. Nøgleårsager til målproteingennemtrængning gennem membranen under UF/DF

1. For højt transmembrantryk (TMP)
Når trykforskellen over membranen er for høj, øges opløsningsmiddelmodstanden, hvilket tvinger noget monomert protein ind i permeatet. Under opskalering- indeholder fødetanken et større volumen af ​​materiale, og tryksvingninger i rørene er mere udtalte, hvilket gør forbigående overtryk mere sandsynligt end i laboratorieskala.

2. Forkert tangentiel flowhastighed
Hvis strømningshastigheden er for lav, dannes der et tæt koncentration-polariseringslag på membranoverfladen, og den lokale proteinkoncentration kan overstige membranens tolerancetærskel. Hvis strømningshastigheden er for høj, kan forskydningsspænding forårsage strukturel spaltning af mAb'et, hvilket genererer mindre proteinfragmenter, der kan passere frit gennem membranporerne.

3. For høj proteinkoncentration i råvaren
Når proteinkoncentrationen i foderet er for høj, ophobes protein på membranoverfladen, og noget monomert protein kan føres ind i permeatet. Dette er et almindeligt problem i stor-produktion.

4. pH eller ledningsevne uden for procesområdet
Ændringer i proteinets ladningskarakteristika kan reducere dets hydreringsradius og tilsyneladende partikelstørrelse, hvilket resulterer i unormal membrangennemtrængning.

5. Membrankassetteældning, høj diffusiv flux eller utilstrækkelig præ-konditionering
Fysiske defekter i membrankassetten kan direkte forårsage proteinlækage og repræsentere en udstyrsrelateret-risiko. Gentagen CIP med stærkt alkaliske opløsninger kan gradvist beskadige polyethersulfon (PES) membranmaterialet.

6. For stort diafiltreringsvolumen
Under langvarig diafiltrering kan kontinuerlig skylning med opløsningsmiddel gradvist bortføre små mængder monomert protein.

 

II. Traditionelle praktiske foranstaltninger til at forhindre målproteingennemtrængning og tab

(A) Procesparameterkontrol

1. Styr transmembrantryk (TMP)
Definer en øvre advarselsgrænse for tryk, og opret interlock-alarmer for at forhindre forbigående højtrykspåvirkninger på membranlaget. Efter at have bestemt basislinjeparametre i lille skala, skal du reducere det sikre driftstryk under opskalering af produktionen og reservere et passende procestoleranceområde.

2. Optimer krydsflowhastigheden
Etabler et stabilt grænselag og reducer koncentrationspolarisering ved membranoverfladen gennem krydsstrømning, hvorved proteinakkumulering på membranoverfladen ved kilden minimeres.

3. Begræns slutkoncentrationen efter koncentration
Definer en koncentrationsgrænse baseret på proteinets fysisk-kemiske egenskaber og undgå for høj foderkoncentration. For mAbs overstiger den rutinemæssige slutkoncentration generelt ikke 50 mg/ml; for nogle aggregerede-tilbøjelige mAbs bør koncentrationen reduceres yderligere.

4. Kontroller foderets pH og ledningsevne
Oprethold en stabil hydratiseret partikelstørrelse af proteinet, og undgå molekylær kontraktion forårsaget af syre/base eller ionstyrkeforstyrrelser-.

(B) Udstyr og betjeningskontrol

1. Udfør membrankassettens integritetstest før hver batch
Udfør en boble-punkttest før produktion af hver batch for at identificere knækkede membranfibre. Beskadigede membrankassetter skal kasseres med det samme for at forhindre kontinuerlig proteinlækage.

2. Standardiser CIP-rengøringsproceduren
Kontroller NaOH-koncentrationen og kontakttiden. Efter stærkt alkalisk rengøring skal membranmaterialet afbalanceres fuldstændigt for at reducere risikoen for membranporedeformation.

3. Brug trinvis diafiltrering
Brug en stor-bufferudveksling i det tidlige stadie til at fjerne salte, og sænk diafiltreringsflowhastigheden, når slutpunktet nærmer sig, for at reducere proteinmodstand og -tab.

 

III. Etablering af et procesdesignrum gennem DOE (QbD Process Characterization; Gælder for IND-indsendelse)

1. Faktorscreening
Screen fem vigtige UF/DF-procesparametre (P): transmembrantryk, fødestrømningshastighed, initial proteinkoncentration, foder-pH og driftstemperatur.
Responsvariabler: bibeholdt udbytte, proteinindhold i permeatet, membranflux og procentdel af høj-molekylære-aggregater.

Gennem signifikansanalyse identificere de nøglefaktorer, der bidrager til proteinlækage.

2. Respons overflade modellering
Vælg de fire parametre med den højeste betydning for at konstruere en responsoverflade og analysere interaktioner mellem parametre. Under mange driftsforhold kan en enkelt parameter forblive inden for sit kvalificerede område, mens kombinationen af ​​to parametre kan resultere i proteingennemtrængning. Sådanne interaktionseffekter kan ikke identificeres gennem traditionelle én-faktor-ad{4}}-eksperimenter. Baseret på modellen skal du definere et designrum, der kan betjenes. Så længe procesparametrene forbliver inden for dette område, kan effektiv proteinretention sikres, mens urenheder fjernes ved diafiltrering.

3. Worst-udfordring (påkrævet for proceskarakterisering)
Vælg procesparametre ved yderpunkterne af driftsgrænserne for at simulere produktionsvariabilitet: maksimal TMP, minimum krydsflowhastighed og øvre-proteinkoncentration. Bekræft, at selv under ekstreme driftsforhold ikke forekommer tab af-målprotein i stor skala, og derved opfylder kravene til CMC-gennemgang.

 

IV. Flere analytiske metoder til at identificere proteiner detekteret i permeatet og skelne mål-mAb, nedbrydningsfragmenter og HCP

Baseret på analytisk effektivitet, omkostninger og regulatoriske indsendelsesscenarier kan metoderne opdeles i to kategorier: hurtig screening og bekræftende test. Hurtige metoder bør prioriteres til rutinemæssig procesovervågning; når der opstår unormale afvigelser, bør der anvendes præcise identifikationsmetoder.

1. UV-spektrofotometri (hurtig onlinescreening; foretrukket til rutinemæssig butiks-gulvovervågning)
Saml permeatet og mål dets A280-absorbans. Dette kan kun afgøre, om protein er til stede i permeatet og kan ikke skelne proteinarterne. Det bruges hovedsageligt til rutinemæssig procesovervågning. En kontinuerligt stigende A280-værdi indikerer forværret proteinlækage og kræver øjeblikkelig suspension af diafiltrering og undersøgelse af processen.

2. SDS-PAGE-elektroforese (mest almindeligt anvendte kvalitative identifikationsmetode)
Brug reducerende og ikke-reducerende elektroforese, og sammenlign båndpositionerne med dem for mål-mAb'en i råmaterialet:
1) Hvis båndpositionen er fuldstændig i overensstemmelse med mål-mAb'en, har intakt mAb gennemtrængt membranen.
2) Hvis der opstår bånd med lavere-molekylvægt-, har proteinet undergået hydrolytisk spaltning, hvilket genererer mAb-fragmenter.
3) Hvis båndene er spredt med flere forskellige bånd, er de fleste værtscelleproteiner (HCP'er) fra E. coli/CHO-værtsceller i stedet for målproduktet.

3. Høj-størrelses-udelukkelseskromatografi (HPSEC)
Adskil komponenter efter molekylstørrelse og sammenlign deres elueringstider med råstofkromatogrammet:
- En hovedtop med samme retentionstid som mAb indikerer intakt målprotein.
- En top, der elueres tidligere, indikerer høj-molekylære- aggregater/fragmenter.
- En top, der elueres senere, indikerer lav-molekylære-vægtnedbrydningsfragmenter.
- Fraværet af en karakteristisk hovedtop indikerer HCP-urenhedsproteiner.
Denne metode kan give kvantitative data og kan inkluderes i procesafvigelsesundersøgelsesrapporter; det har høj accept i kliniske indsendelsesmaterialer.

4. HCP-værts-celleprotein ELISA-kittestning
Hvis protein påvises i permeatet, ELISA-resultatet er forhøjet, og HPSEC viser ingen karakteristisk mAb-top, kan det lækkede materiale grundlæggende bestemmes til at være CHO-værts-celleproteiner. Dette indikerer ufuldstændig urenhedsfjernelse under opstrømsrensning; urenhederne vaskes ud under UF/DF-stadiet og repræsenterer ikke produkttab.

5. Verifikation af affinitetskromatografi (protein A-kromatografi)
Protein A binder specifikt til Fc-regionen af ​​mAbs. Fyld permeatprøven på søjlen: udseendet af en karakteristisk elueringstop indikerer tilstedeværelsen af ​​intakt målantistof; fraværet af en elueringstop viser, at proteinerne i permeatet alle er urenhedsproteiner.

6. Massespektrometri (LC-MS) (i-dybdesporbarhed; bruges til undersøgelse af større procesafvigelser)
LC-MS kan analysere aminosyresekvensen direkte og nøjagtigt bestemme oprindelsen af ​​proteinet. Det bruges hovedsageligt til undersøgelse af vanskelige eller usædvanlige afvigelser og bruges ikke som en rutinemæssig-proceskontroltest.

V. Korrigerende handlinger svarende til forskellige analytiske resultater

1. Intakt mål mAb detekteret i permeatet
Reducer det transmembrane tryk og den endelige koncentration efter koncentration; indsnævre procesdriftsområdet baseret på DOE-resultater; og kontroller membrankassettens integritet.

2. Antistofnedbrydningsfragmenter påvist i permeatet
Undersøg forskydningsspænding gennem hele processen og pH-ekstremer; optimere det opstrøms virale inaktiveringstrin for at reducere proteinspaltning.

3. Kun HCP-urenhedsproteiner påvist i permeatet
Der kræves ingen justering af UF/DF-parametre. Spor problemet tilbage til de foregående kromatografitrin, og forbedre urenhedsfjernelsen under affinitets- og ionbytningskromatografi.-

 

VI. Oversigt

For at forhindre proteinlækage under UF/DF, er traditionel proceskontrol afhængig af historisk erfaring til at definere individuelle punktparametre, som kun i tilstrækkelig grad kan adressere stabil produktion i lille-skala. For at sikre stabil ydeevne under trinvis proces opskalering-, bør DOE-baseret proceskarakterisering bruges til at etablere et procesdesignrum med tilstrækkelig tolerance. Interval-baseret parameterkontrol kan kompensere for produktionsvariabilitet. Når først protein er påvist i permeatet, kan et simpelt UV-detektionssystem give en indledende advarsel efterfulgt af elektroforese, HPSEC og ELISA for sporbarhed og identifikation. Dette muliggør nøjagtig differentiering mellem målproduktet og værts-celleurenheder, hvilket muliggør målrettet undersøgelse af rodårsagen og korrigerende handlinger. Dette er også en standardiseret forskningskomponent, der i øjeblikket er inkluderet i CMC-dokumentation for mAb-projekter.