Oversigt:

Denne artikel gennemgår to nøglefaktorer, der skal overvejes i proteinrensningsstrategier: nedstrøms applikationskrav og de biologiske egenskaber ved proteinerne selv. Artiklen understreger, at proteinoprensning af høj kvalitet er grundlaget for pålideligheden og gentageligheden af ​​eksperimentelle data, især til produktion af rekombinante proteiner. Forskellige applikationsscenarier har specifikke krav til proteiner renhed, aktivitet eller endotoksinindhold, og proteineregenskaber kan påvirke oprensningsstrategierne markant. I henhold til specifikke tilfælde illustrerer artiklen, at unikke proteiner skal vedtage tilpassede oprensningsordninger. Endelig blev der foreslået en systematisk proteinproduktionsproces (figur 1), der understregede fuld-process-kvalitetskontrol fra udvælgelsen af ​​ekspressionssystemer, konstruktionsdesign til oprensningsoptimering og anbefaler evalueringen af ​​proteinhomogenitet og funktionalitet gennem biofysiske teknikker (såsom SEC-MALS, DSF osv.). Denne artikel sigter mod at give praktisk vejledning til forskere, hvilket hjælper dem med at formulere effektive og gentagne rensningsstrategier baseret på egenskaber og anvendelseskrav til målproteiner, hvilket øger kvaliteten og effektiviteten af ​​videnskabelig forskning.

 

Figur 1. Skematisk diagram over proteinproduktionsprocessen

 

Produktion med høj efterspørgsel

 

1.nucleinsyrebinding til protein:

Ved rensning af nukleinsyrebindende proteiner kræves der flere trin for at fjerne nukleinsyreforurening. Under lysis skal nukleaser (såsom SM -nuklease (benzonase®) eller DNase eller RNase) tilsættes, men de bundne nukleinsyrer kan ikke fjernes fuldstændigt. Udskift trinnene til fjernelse af nukleinsyre, såsom PEI eller streptomycinsulfatudfældning, heparinoprensning eller ionbytningskromatografi. Tilstedeværelsen af ​​nukleinsyrer blev overvåget ved forholdet mellem A26 0 nm\/A28 0 nm i hele oprensningsprocessen. Hvis forholdet var lavere end 0,6, indikerede det, at proteinrenheden var relativt høj, og nukleinsyrekontamineringen var minimal. For proteiner med stærkt bundne nukleinsyrer kan de denatureres midlertidigt (såsom behandlet med urinstof) og derefter renatures. Nøglepunkter: Brug reagenser af høj kvalitet, friske buffere og rene søjler (rene med 0,5 m NaOH før brug).

 

2. Mus ferritin tung kæde:

Formålet med at producere oprenset mus ferritin tung kæde (MFTH1) protein er højopløsning med en-partikel-kryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM). Escherichia coli -ekspressionsvektoren kodet umærket MFTH1 blev ultralydforstyrret uden at tilføje nogen nuklease. Efter opvarmning ved 7 0 grad gennemgik den ammoniumsulfatudfældning, dialyse og størrelseseksklusionskromatograferingstrin. Den resulterende prøve viste tilstedeværelsen af ​​en stor mængde forurenende stoffer i kryo-elektronmikroskopibilleder (figur 2A), som var helt uegnet til dens anvendelse. Optimer trinnene. Tilføj SM -nuklease under cellelyseringsprocessen og dialyseprocessen efter ammoniumsulfatudfældning, og tilsæt derefter anionudvekslingskromatograferingstrinnet for at reducere forholdet mellem A26 0 nm\/A280Nm fra 1,4 til 0,8. Efter størrelseseksklusionskromatografi var forholdet mellem A260NM\/A280NM af den endelige MFTH1 -prøve 0,56. SDS-PAGE og kryo-elektronmikroskopibilleder (figur 2B) viste, at proteinet var meget rent, hvilket indikerede, at forurenende stoffer var blevet fjernet effektivt.

Figur 2 Mus ferritin tung kæde

 

 

 

3. kimært protein Human DSRBEC (DSRBD-EGF- CHIMERA):

DSRBEC dannes ved fusion af det dobbeltstrengede RNA-bindingsdomæne (DSRBD) af humant proteinkinase R og human epidermal vækstfaktor (HEGF). Når DSRBD udtrykkes i Escherichia coli, viser det en ekstremt høj dsRNA -bindingsevne. Efter cellelysering vil den forurenende RNA hindre bindingen af ​​rekombinante proteiner til den faste metalion -affinitetskromatografi (IMAC) -søjle. Konventionelle metoder, såsom PEI eller streptomycinsulfatudfældning, RNase-behandling eller højsaltbufferopløsninger, kan ikke fjerne RNA. Cellelysering blev udført under anvendelse af en puffer indeholdende 4M urinstof. Supernatanten blev fyldt på en iMac -søjle, og 4 m til 0 m urinstof blev langsomt anvendt natten over (søjle renaturering). Renatureringsbufferen blev tilsat med imidazol og elueret fra iMac -søjlen. Den endelige forfining blev udført gennem Superdex 75 gelfiltrering for at opnå funktionelt aktiv DSRBEC.

 

4. proteiner bundet til divalente kationer eller andre kofaktorer:

For proteiner, der interagerer med divalente kationer, såsom Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+ eller andre cofaktorer, er det vigtigt at tilføje specifikke divalente kationer (eller andre kofaktorer) under ekspression. En lille mængde af de samme divalente kationer (eller andre kofaktorer) er også påkrævet under oprensningsprocessen. Imidlertid skal brugen af ​​eventuelle chelateringsmidler (såsom EDTA, EGTA) og chelating -reduktionsmidler (såsom DTT eller DTE) undgås. Når man beskæftiger sig med proteiner, der er bundet til divalente kationer, skal en blanding af proteaseinhibitorer uden chelateringsmidler anvendes til at bekræfte den faktiske tilstedeværelse af divalente kationer (eller andre cofaktorer) i det oprensede protein gennem spektroskopiske metoder (såsom atomabsorptionsspektrophotometry).

 

5. Rekombinant ferridoxin (RFD) indeholdende en enkelt [2Fe ± 2s] klynge fra termofile cyanobakterier mastigocladus laminosus

Ferridoxin er et opløseligt jern-svovlprotein, der deltager i elektronoverførselsreaktioner. Feroredoxin af plantetype bærer en enkelt [2Fe ± 2S] -klynge som en elektronacceptor af fotosystem I. Escherichia coli BL21 (DE3) -stammen udtrykte den rekombinante RFD-protein i TB-mediet indeholdende 10 mm FECL3 og antibiotika. Eluering af iMac -fangstsøjlen blev udført under anvendelse af en puffer indeholdende 10 mM histidin for at undgå imidazol og forhindre ødelæggelse af [2FE ± 2S] -klyngen. Anionudvekslings- og størrelseseksklusionskromatografi blev anvendt til yderligere oprensning og koncentration til 12 mg\/ml til screening af krystallisation. Sammenlignet med den rekombinante produktion af ferredoxin opnåede den naturlige ferredoxin oprenset fra den blågrønne alge mastigocladus laminosus højere opløsning under krystallisation.

 

6. Proteiner, der bruges som antigener

Proteiner bruges ofte som antigener til at genvinde målspecifikke ligander. Den første ting at overveje er, om proteinet bruges til in vivo -immunitet for at opnå konventionelle monoklonale eller polyklonale IgG eller til programmer, der involverer kamel -IgG eller in vitro -selektionsprocesser.

 

6.1 Antigener, der bruges til rutinemæssig antistofproduktion

Når antigener anvendes til at producere monoklonale IgG -antistoffer, er den korrekte foldning af antigenet normalt ikke nødvendigt, fordi de fleste monoklonale antistoffer genkender lineære epitoper, der ikke er stærkt påvirket af strukturen af ​​antigenet, og endda denaturerede antigener (såsom inklusion kropsproteiner) forbliver effektive. Imidlertid skal renheden kontrolleres strengt for at undgå stærke immunogene forurenende stoffer, der forstyrrer immunresponsen og forårsager dominansen af ​​ikke-målantistoffer.

 

6.2 Screening af det konjugerede bibliotek

Der skal lægges særlig vægt på at opretholde den naturlige konformation af antigenet under behandlingen af ​​Nanobody -biblioteket opnået ved kamelimmunisering. I modsætning til konventionelle antistoffer har kamelantistoffer (især nanobodier) en tendens til at genkende strukturelle epitoper, som er relateret til deres unikke konvekse komplementære stedstruktur. Tilsvarende, når man screener store syntetiske eller naturlige antistofbiblioteker in vitro, skal antigenet opretholde en struktur, der er helt i overensstemmelse med målapplikationen. Da selve screeningsprocessen er ikke-partisk, hvis antigenet har fejlfoldning, aggregering eller konformationel heterogenitet, kan et stort antal konjugater, der er målrettet mod ikke-naturlige epitoper, screenes.

 

 

 

7. Proteiner, der indeholder intermolekylære eller intramolekylære disulfidbindinger eller fri cystein

Disulfidbindinger er afgørende for at stabilisere den naturlige struktur af proteiner. Under oprensningsprocessen, når man renser proteiner, der indeholder intermolekylære eller intramolekylære disulfidbindinger, er det nødvendigt at undgå at tilføje reduktionsmidler for at forhindre konformationelle ændringer af proteinerne og derved ændre deres funktioner. For proteiner, der indeholder fri cystein, er reduktionsmidler uundværlige i alle trin i oprensningsprocessen, især under opbevaring, for at forhindre dannelse af kunstige disulfidbindinger. De mest almindeligt anvendte reduktionsmidler er dithiothreitol (DTT), -mercaptoethanol (-ME) og Tris (2- carboxyethyl) phosphinhydrochlorid (TCEP). For iMac -harpikser, der er uforenelige med DTT eller TCEP, anbefales det at bruge -Me og erstatte dem med andre reduktionsmidler i efterfølgende trin.

 

8. Rekombinant antistoffragment

Selvom strukturen af ​​rekombinante antistoffragmenter (såsom nanobodier) er enklere end IgG, afhænger deres funktion af den korrekte dannelse af disulfidbindinger. I bakterielle ekspressionssystemer, selv med vedtagelsen af ​​optimeringsstrategier, kan der stadig forekomme fejlfoldede eller delvist foldede produkter, som findes både i den opløselige del og i inkluderingsorganet. Mere skjult er, at selv korrekt foldede antistoffragmenter kan danne opløselige aggregater (kolloid aggregering) gennem hydrofobe plaques på overfladen. Sådanne aggregater er vanskelige at identificere i rutinemæssige funktionelle tests (såsom ELISA), fordi multivalent binding kan maskere faldet i monomeraffinitet, men deres tilstedeværelse kan alvorligt påvirke anvendelser, der er afhængige af lille molekylstørrelse (såsom superopløsningsmikroskopi). Derfor er det ikke tilstrækkeligt at stole på SDS-PAGE til at evaluere prøvekvaliteten. Biofysiske metoder, såsom gelfiltrering (figur 3), skal vedtages for at skelne monomerer (hovedtoppe) fra aggregater (ekskluderingsvolumen toppe). De vigtigste kontrolpunkter inkluderer: Optimering af redox -miljøet under ekspression for at fremme dannelse af disulfidbinding og optimere opbevaringsbetingelser efter oprensning for at forhindre aggregering. Disse mål er afgørende for at sikre monodispersiteten og funktionen af ​​antistoffragmenterne.

Figur 3. Gelfiltreringsadskillelse af opløselige aggregater af nanobodier

 

9. Opløselige fragmenter af lymfocytreceptor LLT1

Rekombinant ekspression af disulfidbindingsafhængige proteiner (såsom lymfocytreceptor LLT1) står ofte over for foldningsproblemer. Gelfiltrering af vildtype LLT1 viste aggregeringstoppe og dimertoppe (figur 4A), men massespektrometri afslørede misfoldning forårsaget af uparret cystein i dimeren (figur 4B). Til dette formål blev to mutanter designet: den ene fjernede problemet cystein, hvilket resulterede i et pludseligt fald i udbyttet (figur 4A); Efter introduktionen af ​​neocystein for at rekonstruere den overensstemmede disulfidbinding havde mutanten ikke kun et højt udbytte og god stabilitet, men også kunne krystallisere (figur 4C), og 3D -strukturen bekræftede, at mutanten dannede den korrekte disulfidbinding og opretholdt den naturlige foldning. Denne sag viser, at ved rationelt design af konform disulfidbindinger kombineret med gelfiltrering og massespektrometri -analyse, kan foldproblemet med rekombinante proteiner løses effektivt, og funktionelle proteiner med stabile strukturer og høje udbytter kan opnås.

Figur 4. Disulfidbindingsrekonstruktion forbedrer foldning og udbytte af opløselig LLT1

 

 

 

10. Let aggregable proteiner

Oprensning af rekombinante proteiner står ofte over for aggregeringsproblemet, og dens dannelse følger "nukleationsvækst" -mekanismen-en lille mængde opløselige aggregater dannes først og udløser derefter storstilet uopløselig aggregering. For at tackle denne udfordring skal der vedtages multi-niveau-strategier: på udtryksfasen kan dette opnås ved at optimere stammen, reducere kulturtemperaturen, bruge modificerede kulturmedier eller forskellige solubiliserende fusionsproteiner og udskifte ekspressionssystem IMac til Sec) skal vedtages for hurtigt at fjerne samlede kerner. Generelt skal man tage hensyn til screeningsbufferopløsninger, faktorer som komponentsammensætning, pH -værdi, dissocierende middel eller solubilizer (figur 5). Gennem fin optimering af ortogonal detektion (såsom SEC, CD, LS, DSF og temperaturskift baseret på fluorescensvarme osv.) Blev proteinkvaliteten og den mest passende pufferopløsning bestemt.

Figur 5. Strategier til at lindre proteinaggregering

 

11. Krystallisation af human CLK1 -kinase (hvordan man får reproducerbare batches)

For at opnå homogen ikke-phosphoryleret CLK1-kinase til krystallisationsundersøgelser blev der vedtaget en multi-strategisk samarbejdsordning. For det første blev det co -udtrykket med λ -phosphatase i Escherichia coli for at eliminere heterogeniteten af ​​autophosphorylering. Selvom udbyttet blev reduceret, blev der sikret fuldstændig dephosphorylering. Efter indfangning af iMac blev elueringsmidlet suppleret med stabilisatorer (50 mm arginin, 50 mm glutaminsyre og 10 mm DTT) for at forhindre aggregering, koncentreret, og hans tag blev fjernet ved TEV -fordøjelse. Derefter blev den korrekte oligomer adskilt med SEC (indeholdende 5% glycerol og -ME). Det endelige afgørende anionudvekslingstrin skelner mellem krystallinske (ikke-phosphorylerede) og ikke-krystallinske (delvist phosphorylerede) CLK1-grupper. Det er især værd at bemærke, at tilstanden for cellelysering signifikant påvirker proteinstabilitet-højtryks- og høj-temperaturmetoden fører til irreversibel aggregering af CLK1, hvilket fremhæver vigtigheden af ​​mild behandling til kinaseforberedelse.

 

 

 

12. Produktion af galectin -1 med stabil ligandbindende evne

For at fremstille funktionelt galectin -1 til ligandbindingsundersøgelser blev ekspressions- og oprensningsstrategierne for fire konstruktioner (umærkede og HIS-mærket vildtype-galectin -1, umærket og HIS-mærket cysteinfri mutant galektin -1). De vigtigste fund indikerer, at lactose -affinitetskromatografioprensning effektivt kan screenes for korrekt foldede proteiner, men det skal kombineres med grundig dialyse (HEPES -puffer) for at fjerne laktose fuldstændigt fra bindingsstedet og gendanne CRD -aktivitet. Galectin af vildtype -1 er tilbøjelig til oxidation og inaktivering, og dens stabilitet forbliver begrænset, selv i nærvær af reducerende midler (figur 6). Den cysteinfri mutant forbedrer imidlertid signifikant langvarig stabilitet, mens den opretholder sammenlignelig agglutinationsaktivitet og termisk stabilitet (verificeret af NANODSF, ITC osv.) Ved at eliminere disulfidbindingsafhængighed.

Figur 6. Den hydrodynamiske karakterisering af rekombinant galectin -1 afslører dets ustabilitet

 

13. Fjernelse af endotoksin

Metoden til fjernelse af endotoksin er baseret på affinitetskromatografi inklusive positivt ladet kromatografi (anionudveksling), anvendelse af polycationiske ligander (såsom poly-L-lysin (PLL), immobiliseret polyamin (polymyxin B)) og tilsætning af den overfladeaktive triton X -114. Under rensningsprocessen skal du være opmærksom på at forberede pufferopløsningen med LPS-fri vand og bruge nye søjler eller kolonner, der kun er blevet brugt i andre LPS-frie rensninger. Til endotoksinforurening kan det kromatografiske pumpe\/væskesystem inkuberes natten over i 0. 5m NaOH eller i 4 timer i 1. 0 m NaOH. Den endelige mængde LP'er i prøven blev evalueret under anvendelse af limulus amebocytlysatreagens (LAL), og det blev verificeret, om det var under den grænse, der kræves til den specifikke anvendelse.

 

14. Proteinkompleks

Udtrykket og oprensningen af ​​proteinkomplekser skal optimeres i henhold til specifikke betingelser. Udfordringer inkluderer ustabilitet eller fejlfoldning af underenheder. Hver underenhed kan udtrykkes uafhængigt og samles in vitro eller co-udtrykkes til dannelse af funktionelle proteinkomplekser. Konstruktionsdesignet skal indføres omhyggeligt med oprensning eller detektionsmærker for at undgå at forstyrre samlingen, især når de komplekse oplysninger er begrænsede og flere optimeringer er påkrævet. Under rensningsprocessen skal integriteten og stabiliteten af ​​det komplekse evalueres. Metoderne inkluderer SDS-PAGE (underenhedsdetektion), SEC (homogenitet), SEC-MALS (molmasseanalyse), massefotometri eller naturlig massespektrometri (masseverifikation). Det skal bemærkes, at komplekset kan adskille sig ved lave koncentrationer. På dette tidspunkt skal den kromatografiske metode eller buffer (såsom gennem termisk drift eller DSF -screeningsbetingelser) optimeres. Endvidere kan reducere oprensningstrinnene forhindre tab af svage interaktionsunderenheder og afbalancere oprensningseffektiviteten og kompleksets integritet.

 

 

 

15. Oprensning af antigen-antistofkomplekser

Antistof-antigenkomplekser er typiske eksempler på proteinkomplekser. Deres co-krystallisation kan afsløre bindingsmønstre og vejlede optimering af antistofteknik. Traditionelle metoder kræver separat oprensning af antigener og antistoffer og blander dem derefter. Imidlertid har nylige undersøgelser vist, at co-ekspressions- og courificeringsstrategier er mere effektive. Kun en enkelt oprensning er nødvendig for at opnå komplekset, og på samme tid kan ustabile antigener stabiliseres gennem antistoffer, og endda etiketfrit ekspression kan opnås. I denne specifikke situation er SDS-PAGE og gelfiltrering (SEC) normalt tilstrækkelige til at evaluere renheden og kvaliteten af ​​komplekset.

 

Oversigt

Proteinoprensning er en grundlæggende teknologi inden for videnskabelig forskning. Akademisk skala proteinproduktion følger normalt standardstrategier og kan producere milligram-niveau højrulhed, opløselige proteiner, der er vidt brugt i strukturel biologi, biokemi og funktionel forskning. Imidlertid kræver de særlige krav til nedstrømsapplikationer (såsom behovet for ingen endotoksin i dyreforsøg og ingen nukleaseforurening i nukleinsyreforskning) eller de iboende egenskaber ved proteiner (såsom let aggregering, der indeholder disulfidbindinger eller høj nukleinsyreaffinitet) ofte tilpassede løsninger. Denne gennemgang, som svar på disse særlige omstændigheder, foreslår raffinerede strategier, der spænder fra udvælgelsen af ​​ekspressionssystemer, design af konstruktioner (optimering af etiketter og domænegrænser) til oprensningsprocessen og introducerer kvalitetskontrol (såsom SEC, SDS-PAGE, aktivitetsdetektion osv.) På centrale trin. Nogle applikationer kræver også yderligere analyse (såsom endotoksindetektion og bestemmelse af nukleinsyrerester), svarende til "Quality Assurance" (QA) -konceptet i den biofarmaceutiske industri, det vil sige for at forhindre defekter gennem systematiske processer. Ved at formulere retningslinjer for kvalitetskontrol og afklare specifikke standarder for proteinreagenser, der er anvendt i videnskabelig forskning, er målet at etablere mere strengt proteinrensningsnormer for akademiske laboratorier, forbedre pålideligheden og gentageligheden af ​​eksperimentelle data og bygge bro mellem grundlæggende forskning og industrielle standarder.

 

Doi: 10.1186\/s 12934-022-01778-5