Grundlæggende principper og arbejdsgang for solid-Phase Peptide Synthesis (SPPS)
Fast-fase peptidsyntese (SPPS)er en metode til at syntetisere peptider på et fast underlag. De vigtigste SPPS-strategier omfatterBoc metodeog denFmoc metode. Peptidsyntese er en gentagen proces med sekventiel aminosyretilsætning og udføres generelt fraC-terminal (carboxylende)tilN-terminal (aminoende). For det første er carboxylgruppen i den første aminosyre i målpeptidet kovalent bundet til en fast bærer (harpiks). Ved at bruge aminogruppen i denne aminosyre som udgangspunkt fjernes den N--terminale beskyttelsesgruppe, og den voksende peptidkæde forlænges ved reaktion med et overskud af en aktiveret anden aminosyre. Denne cyklus-kobling → vask → afbeskyttelse → neutralisering og vask → næste kobling-gentages, indtil den ønskede peptidlængde er opnået. Til sidst spaltes peptidkæden fra harpiksen og renses for at opnå målpeptidet. Når -aminogruppen er beskyttet medBoc (tert-butyloxycarbonyl), benævnes metodenBoc-baseret peptidsyntese i fast-fase. Når -aminogruppen er beskyttet medFmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl), er det kendt somFmoc-baseret peptidsyntese i fast-fase.
Boc-baseret fast-fasepeptidsyntese (Boc-metode)
I denBoc metode, Boc-grupper, der kan fjernes med trifluoreddikesyre (TFA)bruges til at beskytte -aminogrupperne, mensbenzyl-beskyttelsesgrupperer ansat til sidekæder. Under syntesen bliver en Boc-beskyttet -aminosyre først kovalent bundet til harpiksen. Boc-gruppen fjernes derefter med TFA, og den resulterende frie aminoterminal neutraliseres med triethylamin. Den næste aminosyre aktiveres vhaDCC (dicyclohexylcarbodiimid)og koblet for at forlænge peptidkæden. Efter afslutning af samlingen spaltes målpeptidet fra harpiksen ved hjælp af en stærk syre, typiskvandfrit hydrogenfluorid (HF)ellertrifluormethansulfonsyre (TFMSA)I Boc-syntesemetoden kræves gentagne syrebehandlinger for at fjerne beskyttelsesgrupper før hvert koblingstrin. Dette kan føre til adskillige sidereaktioner, såsom for tidlig spaltning af peptidet fra harpiksen og ustabilitet af aminosyresidekæder under sure forhold, hvilket resulterer i uønskede sidereaktioner.
Fmoc-baseret fast-fasepeptidsyntese (Fmoc-metode)
I1978, Meienhofer og Athertonudviklet en peptidsyntesestrategi vhaFmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl)som -aminobeskyttelsesgruppen, kendt somFmoc metode. I denne tilgang er -aminogruppen beskyttet medbase-labile Fmoc, mens sidekæderne er beskyttet medsyre-labile Boc-beskyttelsesgrupper.En stor fordel ved Fmoc som en amino-beskyttende gruppe er densstabilitet under sure forhold; det påvirkes ikke af behandling med reagenser som f.ekstrifluoreddikesyre (TFA)og kan selektivt fjernes vhamild base. Samtidig er side-beskyttelsesgrupper som Boc stabile under basiske forhold og fjernes under sur behandling. Til sidst spaltes peptidet kvantitativt fra harpiksen vha.TFA/dichlormethan (DCM), undgå brug af stærke syrer og derved forbedre sikkerhed og kompatibilitet med rutinemæssig peptidsyntese.
Udviklingshistorie for fast-Phase Peptide Synthesis (SPPS)
1. Grundlæggende fase (begyndelsen af det 20. århundrede til 1963)
I1902, Emil Fischervar den første til at udforske peptidsyntese, men fremskridtene var langsom på grund af tekniske begrænsninger. Tidlige synteser anvendtbenzoyl- og acetylbeskyttelsesgrupper, som var svære at fjerne og ofte førte tilpeptidkædespaltning.
I1932, Max Bergmannog-medarbejdere introduceredebenzyloxycarbonyl (Z) gruppesom en -aminobeskyttelsesgruppe. Denne gruppe kunne fjernes underkatalytisk hydrogenering eller sure forhold, der giver et mere pålideligt værktøj til peptidsyntese og lægger grundlaget for udviklingen af fastfase peptidsyntese i 1960'erne.
I løbet af1950s, videnskabsmænd med succes syntetiseret en række afbiologisk aktive peptider, som f.eksoxytocin og insulin. Disse resultater fremmede peptidkemien yderligere og etablerede grundlaget for fremkomsten af fastfase-peptidsyntese.
2. Pioneering Stage (1963)
I1963, Robert B. Merrifieldforeslogfastfase peptidsyntese-metoden (SPPS)., hvoriC-terminal aminosyreer forankret til en harpiksunderstøtning, og peptidkæden forlænges gennem gentagne cyklusser afafbeskyttelse og kobling. Denne tilgang forenklede i høj grad peptidsynteseprocessen og blev denforetrukne metodetil peptidsamling.
Merrifield brugtBoc (tert-butyloxycarbonyl)for at beskytte -aminogruppen. I slutningen af 1960'erne udviklede han ogsåførste fuldt automatiserede peptidsynthesizerog syntetiseret med succesbiologiske proteinersom f.eksribonuklease (124 aminosyrer). For disse banebrydende præstationer blev Merrifield tildeltNobelprisen i kemi i 1984.
3. Den teknologiske innovationsfase (1972)
I1972, Lou Carpinoudviklede9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) beskyttelsesgruppe, hvilket kan værefjernes forsigtigt under grundlæggende forhold, hvilket reducerer bivirkninger. Dette gjorde den særdeles velegnet tilkomplekse peptiderogautomatiseret syntese.
DeFmoc metodegradvist erstattet Boc-metoden som mainstream-strategien. Automatiserede peptidsynthesizere baseret på beggeFmoc og Boc kemiblev efterfølgende udviklet, drevautomatisering af peptidsynteseog i høj grad forbedre effektiviteten og reproducerbarheden.
4. Modenheds- og ekspansionsfase (1990'erne til i dag)
Harpiks- og reagensoptimering:Udvikling afhøj-belastende, hydrofile PEG-modificerede harpikserog effektive koblingsreagenser som f.eksHBTUogHATUhar væsentligt forbedret effektiviteten og udbyttet af fast-fase peptidsyntese (SPPS).
Teknologisk integration:Nye tilgange sommikrobølgeassisteret-synteseogflowkemihar forkortet reaktionstid og yderligere øget udbytte.
Grundlæggende principper og arbejdsgang for SPPS:
Kerneprincippet i fastfase-peptidsyntese- ertrinvis konstruktion af en peptidkæde på et fast underlag, ved hjælp afbeskytte gruppestrategierogkondensations (koblings)reaktionerat opnåeffektiv og kontrollerbar peptidsamling.
1. Den faste støttes (harpiks) rolle i fast-fasepeptidsyntese (SPPS)
A uopløselig polymerharpiks-såsompolystyren-divinylbenzen tværbundet-harpiks, Wang-harpiks eller Rinkamidharpiks-er valgt som den solide støtte i SPPS. Harpiksoverfladen indeholderfunktionelle grupper(f.eks. hydroxyl- eller aminogrupper), der kan danneskovalente bindinger med den ene ende af peptidkæden, normaltC-terminal, forankring af peptidet til det faste underlag. Denne kovalente binding sikrer, at det voksende peptidforbliver bundet til harpiksen under hele syntesen, hvilket i høj gradletter efterfølgende reaktionstrin, vask og oprensning
2. Beskyttelse af gruppestrategi i fast-fasepeptidsyntese (SPPS)
Under peptidsyntese vil-aminogruppe, carboxylgruppe og reaktive side-funktionelle grupperaf aminosyrer (såsom thiol, carboxyl og aminogrupper) er tilbøjelige tilsidereaktioner. For at forhindre disse uønskede reaktioner,beskyttende grupperbruges. Fælles beskyttelsesgrupper omfatter:-Aminobeskyttende grupper:
Boc (tert-butyloxycarbonyl):Syre-labil, let at fjerne undersure forhold.
Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl):Stabil under sure forhold, kan fjernes undergrundlæggende forhold(f.eks. piperidin/DMF-opløsning).Side-kædebeskyttelsesgrupper:Udvalgt i henhold til de kemiske egenskaber af aminosyresidekæden.ommon grupper omfatterbenzyl (Bn), tert-butyl (tBu), trityl (Trt)osv. Disse grupper erfjernet ved slutningen af syntesen, sædvanligvis under peptidspaltning fra harpiksen, vhasyre eller andre specifikke forhold.
3.C-Terminus til N-Terminussyntese i SPPS
Ifastfase peptidsyntese (SPPS), peptidsamling begynder normalt vedC-terminal (carboxylende)og fortsætter trinvis modN-terminal (aminoende). Dette er fordiC-terminal aminosyre fæstnes først til den faste understøtning, og efterfølgende aminosyrer kobles tilfri aminogruppe i peptidkæden, der allerede er bundet til harpiksengradvis forlængelse af peptidkæden.
4.Koblingsreaktion i fast-fasepeptidsyntese (SPPS)
Beskyttede aminosyrer skal væreaktiveretså derescarboxylgrupper bliver reaktive, så de kan danne enpeptidbindingmed aminogruppen i det harpiks-bundne peptid. Fællesaktiverende reagenseromfattecarbodiimider(f.eks. DCC, DIC),HOBt, HATU, ogPyBOP. Når først den er aktiveret, reagerer carboxylgruppen med den frie aminogruppe i enkondensationsreaktion, danner enamidbindingog derved binde den nye aminosyre til den voksende peptidkæde.
5.Repetitive (cykliske) operationer i fast-fasepeptidsyntese (SPPS)
Processen involverergentagelse af afbeskyttelsescyklussen → kobling → vask, tilføjeren aminosyre pr. cyklusfor gradvist at forlænge peptidkæden. Efter hverkoblingsreaktion, harpiksen ervasket(f.eks. med opløsningsmidler såsom DMF eller DCM) for at fjerne uomsatte reagenser, biprodukter og overskydende aminosyrer. De-aminogruppen i den nyligt tilføjede rest afbeskyttes derefterudsættelse af en fri amin for at forberede den næste koblingsreaktion. Denne cyklus gentages, indtil den ønskede peptidsekvens er fuldstændig samlet.
6.Spaltning i fast-fasepeptidsyntese (SPPS)
Når først peptidkæden har nået den ønskede længde, er den detspaltet fra den faste understøtningved at bruge et passende reagens, samtidigfjerne alle beskyttelsesgrupper. Et almindeligt anvendt spaltningsreagens ertrifluoreddikesyre (TFA), hvilket ikke kunbryder bindingen mellem peptidet og harpiksenmen ogsåfjerner beskyttelsesgruppersåsom Fmoc og Boc, der genopretter peptidet til detsindfødt stat. Når først peptidkæden har nået den ønskede længde, er den detspaltet fra den faste understøtningved at bruge et passende reagens, samtidigfjerne alle beskyttelsesgrupper. Et almindeligt anvendt spaltningsreagens ertrifluoreddikesyre (TFA), hvilket ikke kunbryder bindingen mellem peptidet og harpiksenmen ogsåfjerner beskyttelsesgruppersåsom Fmoc og Boc, der genopretter peptidet til detsindfødt stat.
Gennem disse trin,fastfase peptidsyntese (SPPS)aktiverereffektiv og kontrolleret samling af peptidkæder på et fast underlagundgår de komplicerede mellemliggende oprensningstrin, der kræves i traditionel -opløsningsfasesyntese og væsentligtforbedring af synteseeffektivitet og udbytte.
Gennem disse trin,fastfase peptidsyntese (SPPS)aktiverereffektiv og kontrolleret samling af peptidkæder på et fast underlagundgår de komplicerede mellemliggende oprensningstrin, der kræves i traditionel -opløsningsfasesyntese og væsentligtforbedring af synteseeffektivitet og udbytte.
