Membranteknologi og vaccineafklaring (Ⅰ)

Vacciner kommer fra en række forskellige kilder, herunder vævsekstrakter, bakterieceller, virale partikler, proteiner og nukleinsyrer produceret af pattedyrs rekombinante celler, gær- og insektceller.

Den mest almindelige metode til fremstilling af vaccine er baseret på en indledende fermenteringsproces efterfulgt af oprensning. Vaccineproduktion er en kompleks proces, der involverer mange forskellige trin og processer. At vælge den rigtige oprensningsmetode er afgørende for at opnå den ønskede slutproduktrenhed. Afklaring af vacciner er et vigtigt skridt, som har en væsentlig indflydelse på produktgenvinding og efterfølgende oprensning. Flere teknikker kan bruges til at afklare vacciner. Valget af indsamlingsmetode og udstyr afhænger af batteritypen, arten af ​​det produkt, der indsamles, og procesvæsken. Disse teknikker omfatter membranfiltrering (mikrofiltrering, tangentiel flowfiltrering), centrifugering og dybfiltrering (normal flowfiltrering). Ud fra lang erfaring opnås klaring af vaccinehøst normalt ved centrifugering efterfulgt af dybdefiltrering.

 

I de senere år har membranbaserede teknikker vundet fremtrædende plads i vaccineafklaring. Opstrømsprocesser bruger i stigende grad engangsteknologier, så høststrategier skal ændres. Denne artikel giver et omfattende overblik over forskellige membranbaserede teknologier og deres anvendelser i vaccineafklaring.

 

01 Indledning

Vacciner er en kritisk komponent i vores forebyggelse af infektionssygdomme, som fortsat er en chokerende dødsårsag. Mellem 2 og 3 millioner mennesker reddes fra difteri, stivkrampe, kighoste og mæslinger hvert år takket være immunisering. Vacciner dækker en bred vifte, fra små rekombinante proteiner til hele viruspartikler og hele bakterier. De kan produceres af forskellige systemer: æg, pattedyrceller, bakterier osv. På grund af kompleksiteten og mangfoldigheden af ​​vacciner er der i øjeblikket ingen almindelig oprensningsprotokol eller skabelon, på trods af stigende interesse for vaccineplatforme.

 

Typisk kan en vaccineproces opdeles i tre dele: opstrøms (produktion og klaring), nedstrømsbehandling (oprensning inklusive ultrafiltrering, kromatografi og kemisk behandling) og formulering (slutpåfyldningsoperationer). Uafhængigt af produktionssystemet spiller klaring (den indledende fjernelse af uønskede stoffer) en nøglerolle i fastlæggelsen af ​​en robust rensningsproces. Et ordentligt afklaringstrin fjerner hovedsageligt hele celler, cellerester, kolloider og store aggregater for at reducere byrden ved nedstrømsbehandling. I nogle tilfælde kan klaring også reducere uopløselige urenheder, værtscelleproteiner (HCP) og værtscellenukleinsyrer. Som ethvert andet oprensningstrin skal klaringstrinnet optimeres for at opnå maksimalt produktudbytte og renhed, samtidig med at det tilpasses til vaccinens specificitet og produktionsbegrænsninger.

 

På grund af heterogeniteten af ​​vaccinetyper anvendes en række forskellige teknikker til klaring, herunder centrifugering eller filtrering (tabel 1).

 

Der kræves normalt flere rækker af operationer for at opnå den ønskede afklaring. Den første operation er designet til at fjerne større partikler (primær klaring), og den anden operation er designet til at fjerne kolloider og andre sub-mikron partikler (sekundær klaring). Lavhastighedscentrifugering fungerer som en engangsopklaringsmulighed, der tillader celler og cellerester at blive fjernet ved udfældning. Centrifugering kan håndtere høje faste belastninger og har været meget udbredt i batch- eller kontinuerlig tilstand og skivecentrifuger. Det kræver høje kapitalinvesteringer og vedligeholdelsesomkostninger og står over for udfordringer med at opskalere på grund af manglen på en pålidelig nedskaleringsmodel. Nogle kommercielle vaccineproducenter bruger dog centrifuger i storskalaproduktion, der involverer høje forarbejdningsvolumener og flere produktionsaktiviteter.

 

Klareringsfiltrering kan udføres ved normal flowfiltrering (NFF, også kendt som dead-end filtration) eller tangentiel flowfiltrering (TFF, også kendt som cross-flow filtration). Der er også specifikke filtertilstande (dybe filtre), der indeholder positivt ladede materialer og filter-AIDS, der forbedrer tilbageholdelsen af ​​cellerester, kolloider og negativt ladede uønskede komponenter.

 

Membranfiltre tilbageholder partikler ved størrelsesudelukkelse og har ikke en høj snavsretentionskapacitet, så de er velegnede til sekundære klaringstrin. Både dybe filtre og membranfiltre er nemme at skalere og implementere (simpelt systemdesign). I modsætning til NFF bruges TFF hovedsageligt til primær klaring (mikrofiltrering). Membraner med et afskæringsområde på 0.1-0.65 μm (helst med en åben kanal) er med succes blevet brugt til at tilbageholde celler, cellerester og andre store forurenende stoffer. Det meste TFF-udstyr er lineært skalerbart og genanvendeligt efter rengøring, hvilket reducerer omkostningerne til forbrugsstoffer til trinnet markant.

 

Afklaringstrinnet ligger mellem opstrøms- og nedstrømsprocesserne og bliver nogle gange overset under udvikling af vaccineprocesser, fordi tid og ressourcer prioriteres til andre oprensningstrin, såsom kromatografi eller tæthedsgradientcentrifugering.

 

Selv patenter for vaccinefremstillingsprocesser udelader ofte afklaringstrinnet. Afklaringseffektiviteten påvirker direkte udførelsen af ​​downstream-processen. Et dårligt optimeret klaringstrin kan påvirke kapaciteten af ​​det steriliserede filter negativt eller kan forkorte levetiden for den kromatografiske harpiks. I dag har strammere regulatoriske forventninger en tendens til at få vaccineproducenter til at producere renere, velkarakteriserede, men overkommelige vacciner. I dette tilfælde skal hvert trin gives den opmærksomhed, det fortjener. Aktuelle tendenser tyder på, at opstrømsprocessen bevæger sig mod et "renere" ekspressionssystem (dvs. celler dyrket i serumfri medier erstatter æg) med øget produktivitet og højere celletæthed.

 

Nedstrøms oprensningsprocesser bliver forenklet og strømlinet for at øge renheden af ​​slutproduktet. For at håndtere disse ændringer kan afklaringstrinnet ikke blive en flaskehals. I dette tilfælde imødekommer filtreringsteknologien en ny afklaringsudfordring, der adresserer spørgsmålene om øget procesfleksibilitet, muligheden for engangsbrug og reducerede investeringsomkostninger.

 

02 Afklaring af virusvacciner

Flere typer klaringsmetoder, enten alene eller i kombination, er med succes blevet brugt til at afklare høsten i foderenden af ​​vacciner.

Pilotskala:1-20L, produktionsskala: mere end 20L

 

2.1 Forholdsregler for virusvaccineafklaring

Mange vacciner indeholder alle eller dele af viruspartiklerne for at danne immunitet mod virusinfektion. De falder generelt ind i fire brede kategorier:

Levende svækket vaccine (LAV), som er baseret på en svækket virusstamme for at reducere dens virulens. Svækkede vira kan replikere i kroppen, men er ikke sygdomsfremkaldende.

- Inaktiveret virus (IV) vacciner, som indeholder kemisk eller ultraviolet inaktiverede vira for at eliminere smitte. Viruspartikler kan være fuldstændige, opdelte eller oprensede (kun antigene proteiner).

- Den virale vektor (VV)-vaccine er en aktiv, ikke-patogen virus, der præsenterer antigenet fra en patogen virus. Disse nyligt udviklede strukturer bruges også til genterapiapplikationer.

Viruslignende partikler (VLP'er), en specifik klasse af virale underenhedsvacciner, der efterligner den overordnede struktur af virale partikler, men som ikke indeholder infektiøst genetisk materiale.

 

I de fleste tilfælde er viruspartiklerne fuldstændigt intakte under klaringstrinnet, selv under lyseringen af ​​den virale vaccine (spaltning udføres sædvanligvis nedstrøms i et mere oprenset miljø).

Den største udfordring ved viral klaring er genvinding af virale partikler med høj udbytte, samtidig med at cellerester, store aggregater og uopløselige kontaminanter fjernes effektivt. Som beskrevet i de følgende afsnit er der flere faktorer, der kan forårsage virusnedbrydning eller -tab. Derudover kan viralt udbytte være vanskeligt at stole på på grund af den høje variabilitet af virale kvantitative assaymetoder på dette trin af processen, især for LAV- og VV-vacciner. For disse vacciner evalueres det virale udbytte ofte ved hjælp af smitteevnetests, såsom plaque-testen eller TCID 50-testen. Det faktum, at nogle af de høstede forbindelser kan interferere med virusets evne til at inficere indikerende celler, øger variabiliteten af ​​denne kvantitative tilgang.

 

2.2 Virusvaccineafklaringsstrategi

Virale vacciner varierer meget i størrelse, struktur, form og ekspressionssystemer (tabel 3).

Som følge heraf er der generelt ingen skabelon for dets downstream-processer, især afklaringstrinene. I teorien kan alle tilgængelige teknikker (lavhastighedscentrifugering, mikrofiltrering TFF, NFF) udvælges og potentielt kombineres for at opklare virussen. Faktisk er succesen med klaringsmetoder påvirket af ekspressionssystemet og de fysisk-kemiske egenskaber af de involverede vira.

 

Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} celler/ml) klaringsmetode, ved brug af kationiske polymerer, reducerede det dybe filtreringsareal med 4 gange sammenlignet med traditionelle metoder. Denne teknik gør det muligt at høste fermentorer med stor kapacitet uden brug af centrifuger. Tilsvarende har Riske et al. viste, at chitosanbehandling af 40 L cellekulturer (0,02%) indeholdende 1,4-2,6% faststof førte til en 7-fold stigning i den absolutte filterkapacitet efter dyb filtrering.

 

De nævner også, at chitosan ser ud til at forbedre klaringseffektiviteten ved at flokkulere submikron partikler, som typisk bundfældes i centrifuger. Forbehandlings- og flokkuleringsmetoder vil sandsynligvis fortsat være en del af fremtidige vaccinefiltreringsafklaringer. Penetranter, herunder sukkerarter, glycoler og aminosyrer, flokkulerer fortrinsvis vira. Viral flokkulering med osmotisk opløsning efterfulgt af 0.2µ mikrofiltrering kan bruges som en omfattende proces til virusoprensning. Penetranter kan stimulere viral aggregering ved at reducere hydreringslaget omkring partiklerne for at flokkulere hydrofobe ikke-indkapslede viruspartikler og indkapslede viruspartikler. Selvom penetranter har vist sig at flokkulere vira, har metoden potentialet til at være en platform for fremtidig vaccineoprensning, og dens gennemførlighed i pilot- eller storskala vaccinerensning er ikke blevet bevist. Flokkulationsforbehandlingsmetoden, som sandsynligvis fortsat vil være en del af fremtidig vaccinefilterafklaring, udføres i en 2L fermentor. For potentielt at blive brugt i store produktionsoperationer skal disse metoder valideres på pilot- og produktionsskalaer.

 

2.2.1 At udtrykke systempåvirkning

Afklaringsmetoden afhænger hovedsageligt af typen af ​​opstrøms proces og ekspressionssystem, som bestemmer typen og niveauet af forurenende stoffer, der skal fjernes. Virale vacciner produceres sædvanligvis i kyllingeembryoner af kontinuerlige cellelinjer fra pattedyr eller fugle eller baculovirus/insektceller, som er et mere komplekst ekspressionssystem. Nogle typer af VLP'er kan også produceres af andre heterologe ekspressionssystemer (bakterier, gær, planteceller).

 

2.2.1.1 Virus produceret i kyllingefoster

Vacciner er blevet produceret i æg i årtier. Dette arbejde går tilbage til 1931, hvor Woodruff og Good Pasture med succes brugte chorio-allantoic membranen fra frugtbare æg som et substrat for viral vækst. I dag produceres der stadig mange humane og veterinære vacciner ved hjælp af denne ældgamle proces. Den mest kendte er nok årstidens influenzavaccine. Princippet er at inokulere hønseæg med vira af interesse og derefter replikere i den chorio-allantoiske membran. Efter reproduktion opsamles og renses allantoisvæske rig på virale partikler.

 

Allantoisk væske er et udfordrende klaringsfoder. Dens høje mineral- og proteinindhold (inklusive ovalbumin) giver den en høj viskositet. Allantoisk væske indeholder også essentielle vævsforbindelser fra kyllingeembryoner, såsom fjer, næb, blodkar eller blodceller. På grund af det høje tørstofindhold er lavhastighedscentrifugering den foretrukne mulighed for primær klaring, hvilket typisk resulterer i en genvindingsgrad på omkring 70 %. Primær klaring ved hjælp af filtreringsteknikker er dog også mulig. Til NFF har polypropylen- og cellulosebaserede dybe filtre gode allantoisvæskeopsamlingsevner. Overfladefiltre fremstillet af polypropylen eller cellulosebaserede dybe filtre kan have en kapacitet på 150-210 L/m² og reducere turbiditeten i fødestrømmen med op til 3 gange. Den åbne foderkanal TFF-anordning er også velegnet til allantoisvæskeafklaring, da enheden er mere velegnet til minimalt tryktab gennem foderkanalen og dermed reducerer kanalblokering.

 

Det sekundære afklaringstrin kan nemt udføres med NFF. En kombination af polypropylen, cellulose og glasfibermaterialer viser generelt god effektivitet, og et alternativ til det sekundære klaringstrin er at bruge TFF og en {{0}}.65μm eller 0.45μm mikrofiltreringsmembrananordning og betjene osmotisk flux kontrollere. En åben kanal TFF-enhed med en hydrofil PVDF eller en hydrofil PES-membran kan bruges i dette trin.

Det er vigtigt at bemærke, at virale partikler kan være forbundet med uopløseligt affaldsmateriale, hvilket kan reducere viral produktion betydeligt under klaring. Brug af en saltopløsning kan reducere denne sammenhæng mellem influenzavirus og faste fragmenter, hvilket resulterer i en groft to gange stigning i produktionen uden at påvirke integriteten af ​​de virale partikler.

 

2.2.1.2 Virus produceret i successive pattedyr- og fuglecellelinjer

For nylig har nogle virale vacciner bevæget sig væk fra ægbaserede processer til fordel for cellekulturbaserede processer (især for influenzavacciner). Hovedårsagen til dette skifte er at forhindre vaccineproduktionsproblemer forbundet med embryonale æg (dvs. mangel på ægforsyning, der kan opstå i tilfælde af et udbrud af fjerkræsygdomme). Som et resultat udvikles mange typer af vacciner og virale vektorer i øjeblikket under anvendelse af kontinuerlige cellelinjer fra pattedyr eller fugle, konventionelle cellelinjer (såsom Vero-, MDCK- eller HEK293-cellelinjer) eller proprietære cellelinjer.

 

Afhængigt af ekspressionssystemet kan virussen forblive inde i cellen, hvilket kræver et cellelysetrin, eller det kan forblive uden for cellen (lyse eller spirende). Den faste belastning og det opløselige indhold opnået fra cellekultur er meget renere end den allantoiske væskefase. Som følge heraf er NFF-teknologien lettere at implementere, og kapaciteten er væsentligt højere. Filtreringskapaciteten er imidlertid meget afhængig af cellekulturbetingelser, såsom celletæthed eller cellelevedygtighed ved høst. Disse parametre påvirker mængden af ​​cellerester og makroaggregater, der kan tilstoppe dybe filtre og membraner, hvilket resulterer i reduceret kapacitet.

 

Thomassen et al giver et godt eksempel på NFF-afklaring. Anvendes i inaktiveret poliovirus (IPV) produktionsproces. Vero-celler dyrket på mikrobærere blev brugt til viral proliferation med en celletæthed på {{0}}.78 x 106 celler/ml TOI. En 75μm skærm i rustfrit stål bruges til forklaring for at fjerne mikrobærere fra høsten. Dobbeltlagsklassificeringen tydeliggøres ved hjælp af et tæthedsdybt filter (0.2-2.0μm), efterfulgt af et steriliseret kvalitetsfilter.

Den valgte skalerbare engangsenhed blev med succes brugt til fremstilling af Sabin IPV klinisk forsøgsmateriale i 350 L skala. Afhængigt af virusserotypen opnås en virusgendannelsesrate på 86 til 96 procent.

 

2.2.1.3 Baculovirus/viruslignende partikler produceret i insektcellesystemet

Overvejelsen af ​​baculovirus/insektcellesystemer til vaccineproduktion i stor skala er relativt ny, men tiltrækker stigende interesse inden for virale vektorer og VLP'er. Den største fordel ved dette system er, at det involverer kortvarig (intet behov for at etablere cellelinjer) og sikker (ingen fuldstændig viralt DNA) produktion. Der er også nogle ulemper, såsom behovet for fjernelse af baculovirus og produktstabilitet.

 

Cervarix, en VLP-vaccine mod human papillomavirusinfektion produceret af GlaxoSmithKline, er den første humane vaccine, der er kommercielt fremstillet i insektceller. En række vacciner baseret på VLP'er og rAAV-vektorer produceret i baculovirus-inficerede insektceller er i øjeblikket under udvikling. Insektcellelinjer afledt af efterårshærorm Spodoptera frugiperda (Sf9 og Sf21) og kålbøjeorm Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4-celler) er de mest almindeligt anvendte på grund af deres evne til at vokse i suspension, hvilket forenkler amplifikation af opstrøms behandle. Efter vækst til den ønskede tæthed af levende celler, inficeres disse celler med rekombinant baculovirus i den eksponentielle cellevækstfase til proteinekspression. Det store genom af baculovirus tillader ekspression af fem eller flere forskellige proteiner, som matcher kompleksiteten af ​​VLP og virale vektorer.

 

Bernard et al. beskrevet nedstrøms processen med insektcellekultur. Processen er meget variabel, hvilket afspejler mangfoldigheden af ​​proteiner produceret med denne teknik. Det første trin i oprensningssekvensen er stærkt påvirket af bioreaktorens volumenkarakteristika (dvs. celletæthed og levedygtighed) eller af arten af ​​produktfrigivelsen (udskilt ved knopskydning eller cellelyse). Baculovirusinfektion af insektceller kan forårsage cellelyse inden for 3-5 dage. Destruktion af celler kan føre til en stigning i proteolytisk aktivitet og andre miljøfaktorer, der kan føre til nedbrydning af rekombinante proteiner.

Der har været forsøg på at udvikle baculovira med en lavere evne til at starte cellelyse. Baculovirus lyser mindre end 10 procent af inficerede insekter.

 

Cellelyse kan udføres ved hjælp af forskellige metoder, såsom fryse-optøning, detergenter, homogenisatorer eller ultralydsbehandling. Insektceller har ingen cellevæg og opløses derfor hurtigt. Selvom ultralydsbehandling er blevet rapporteret i mange bænkprocesser, bruges den sjældent i eksperimentel eller kommerciel skala. Den mest almindelige metode er at bruge en homogenisator til at ødelægge celler i nærværelse af et lavkoncentrationsrengøringsmiddel (0,1 % Triton X-100 eller NP-40). Brugen af ​​detergenter og mikrofluidisering eller osmotisk virkningshomogenisering er med succes blevet anvendt i mange storskala fremstillingsprocesser. Typisk suspenderes insektceller i lyseringsbuffere (50 mM TRIS pH7,7, 300 mM NaCl, 5 % glycerol, 0,2 mM PMSF og proteaseinhibitorer), hvorunder Triton-X100 tilsættes til en slutkoncentration på 0,1 %, efterfulgt af mild ultralyd eller mikrofluidisering. Blandingen centrifugeres derefter for at fjerne uopløselige partikler.

 

På dette stadium kan lysatet virke meget uklart og er svært at filtrere ved hjælp af et 0.45μm-filter. Nogle gange kan der observeres tab på op til 30% under pyrolyse-afklaringstrinnet. Tilsætning af benzoenzymer på spaltningsstadiet hjælper med at løse filtreringsproblemet. Rengøring af cellerne med fosfatpufret saltlage efter høst og hurtig "frys-optøning" i et højt saltindhold (500 mM NaCl) indeholdende krakningsbufferen hjælper med at fjerne aggregaterne.

 

Afklaring af VLP'er og virale vektorer produceret af insektceller sker efter cellelyse (ved kemisk eller mekanisk behandling), som frigiver ikke kun virale partikler, men også store mængder cellulær nukleinsyre. Insektceller er i stand til at vokse ved en høj celletæthed fra 1-9.10 6 celler/ml. Derfor bør afklaringstrinnet omhandle høj celletæthed, højt nukleinsyreindhold og om muligt fjernelse af baculoviruspartikler. For at gøre tingene mere komplicerede kan VLP'er eller virale vektorer og baculovirus have lignende størrelser (baculovirus er 60-80 nanometer brede og 300-400 nanometer lange). På grund af den høje celletæthed har centrifugering været den foretrukne teknik til primær klaring i årtier. Imidlertid ser membranprocesser ud til at være et meget attraktivt alternativ, fordi skalerbarhed er let at definere.

 

Dybe filtre er blevet brugt effektivt i nedstrømsprocessen af ​​trelags rotavirus-lignende partikler. På laboratorieniveau bruges CsCl-densitetsgradient-ultracentrifugeringsmetoden ofte til at oprense disse komplekse partikler. Forskerne evaluerede ikke kun klaringstrinnet for det dybe filter, men også hele nedstrømsprocessen (Triton X-100 spaltning og dyb filtrering, efterfulgt af ultrafiltrering og partikelstørrelsesudelukkelse). Resultaterne viser, at udbyttet af CsCl-densitetsgradient kan nå 37%.

Ultracentrifugalmetoden er omkring 10%. Som et andet eksempel blev 0,45 μm hule fibre og 500 kDa fibre med fin diameter brugt til at genvinde og koncentrere HIV-lignende partikler produceret i insektceller. I denne undersøgelse blev forskydningskraften af ​​hule fibre optimeret baseret på celleintegritet. Resultater En lav forskydningskraft proces blev etableret til at erstatte bordsukkergradient ultracentrifugering.

 

Processen har potentiale til at blive anvendt til masseproduktion. Dybe filtre er også blevet brugt med succes i produktionen af ​​rekombinante adeno-associerede vira. Cellelyse blev udført med en to-stempel mekanisk celle-jammer efterfulgt af nukleasebehandling. I klaringstrinnet blev der brugt et 1,2 μm glasfiber dybt filterelement efterfulgt af to lag af 0.8μm hydrofil PES og 0.2μm hydrofil PES. Filtre i proportional størrelse bruges til procesbatcher fra mindre til 200 L-størrelser. Dybe filtre er blevet brugt med succes, og TFF-vurderinger med flade film eller hule fibre på 0,2 µm eller 0,45 µm er også blevet rapporteret at være meget effektive.

 

Undersøgelsen foretaget af Tecnologica (IBET) ved Oeiras Institute of Experimental Biology i Portugal brugte NFF til at udføre afklaring af hepatitis C VLP udtrykt af baculovirus uden centrifugering. Nominelt klassificerede polypropylenfiltre (10,5,0.6 og 0.3μm) filtre bruges til at afklare VLP-høstning. De samme filtre med 0.6μm og 0.3μm porevurderinger bruges til filtrering i VLP-høstcentre. Alle undersøgte filtrater blev testet for HCV-VLP-genvindingshastigheder, og de anbefalede filtreringsmetoder blev sammenlignet. Resultaterne er vist i tabel 4.

Resultaterne viste, at 5μm-0.3μm-filteret havde den højeste produktgenvinding (100%) for direkte høstet hepatitis C VLP-foder. Polypropylen 0,6 μm filteret havde den højeste produktgenvinding (82 %) for det centrale foder, og DNA-clearancen af ​​værtscellen var omkring 70 %.

 

2.2.1.4 Viruslignende partikler produceret i bakterie- eller gærsystemer

Typen af ​​klaringsmetode for VLP-vacciner udtrykt i bakterie- eller gærsystemer afhænger af frigivelsen af ​​VLP til ekstracellulære mediatorer. Hvis VLP'er ikke kan udskilles effektivt, kan cellelyse eller andre ekstraktionstrin være påkrævet før det faktiske klaringstrin. Selvom dette er guldstandarden i proteinklarningsindustrien, centrifugering (kontinuerlig eller batch) udtrykt i bakterie- eller gærbaserede systemer, er membranprocesser for nylig blevet et meget attraktivt alternativ på grund af deres lette skalerbarhed og kompatibilitet med engangsbrug. behandlinger.

 

Richter og Topell forklarer brugen af ​​centrifugering, TFF eller en kombination af begge ved fremstilling af VLP'er produceret i klaret E. coli. I deres arbejde blev 0.45m TFF-membraner brugt til at fortynde og klare de homogeniserede E. coli-homogenater ved en temperatur på 5 grader. De bemærker også, at membranbaseret TFF er velegnet til håndtering af højviskositetshøster, fortrinsvis ved brug af TFF-enheder med åbne kanalkonfigurationer.

Centrifugal afklaring er også blevet vurderet som et alternativ til TFF. I dette tilfælde blev det resulterende homogenat ikke fortyndet og centrifugeret ved 4 grader i 105 minutter, 10000g. Uden at overføre den bløde coating blev supernatanten hældt ud af partiklerne og gencentrifugeret ved 4 grader og 10.000 g i 60 min. Supernatanten blev derefter fjernet fra de foreliggende partikler, fortyndet med EB-buffer (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris Base, 5,0 mM EDTA, 10 % (v/v) Triton X-100) 1:2 og filtreret på en 0,22 m steril filteranordning. Yderligere forarbejdning. Opskaleringsprocessen til fremstilling af denne VLP-vaccine i E. coli i 800L skala blev også angiveligt klarlagt ved kombinationen af ​​centrifugering og TFF.

 

Den rekombinante hepatitis E-vaccine HEV 239 er blevet godkendt i Kina til immunisering af voksne 16 år og ældre. Vaccineantigener (VLP) udtrykkes i E. coli, og opskalering af antigenproduktionsprocessen har vist sig at være på en 50L skala. Produktet blev ekstraheret ved krakning af E. coli, og inklusionslegemerne blev separeret fra cellefragmenterne ved kraftig vask med en buffer indeholdende 2% Triton X-100 og derefter opløst med en 4 M urinstofhomogenisator. TFF afklarer humant papillomavirus VLP produceret i Saccharomyces cerevisiae (15L). Cellelysatet behandlet med nuklease blev klaret ved krydsstrømsmikrofiltrering i transfiltreringstilstand under anvendelse af 0,65 μm hulfiberfilter. Den samme proces bruges i vaccineproduktion. Selvom kun en håndfuld VLP-baserede vacciner har nået kommerciel skala, er flere VLP-baserede vacciner under udvikling, hvoraf de fleste er klaret ved hjælp af centrifugering eller membranteknologi.

 

Begrænset af rummets indflydelse vil vi dele anden halvdel af indholdet i næste kapitel. I den næste artikel vil vi dele nogle tilfælde af vaccineafklaring og brug af relevante membrankomponenter.

 

Som den første virksomhed i lokaliseringskredsløbet har Guidling Technology oparbejdet tilstrækkelig relevant erfaring med vaccineafklaring. Guidling Technology er en udviklings- og produktionsvirksomhed med fokus på biofarmaceutisk og cellekultur, oprensning og separation. Produkter er meget udbredt i biomedicin, diagnose, industriel væskefiltrering, påvisning, klaring, oprensning og koncentrationsproces; Guidling har med succes udviklet ultrafiltreringscentrifugerør, ultrafiltrerings-/mikrofiltreringsmembrankassette, virusfjernelsesfilter, tangentiel flow-filteranordning, dyb membranstabel osv., som fuldt ud opfylder anvendelsesscenarierne for biofarmaceutisk og cellekultur.

 

Vores membraner og membranfiltre bruges i vid udstrækning til koncentrering, ekstraktion og adskillelse af forfiltrering, mikrofiltrering, ultrafiltrering og nanofiltrering. Vores brede udvalg af produktlinjer, fra små laboratoriefiltrering til engangsbrug til filtreringssystemer af produktionstype, sterilitetstestning, fermentering, cellekultur og mere, kan opfylde behovene for test og produktion.