Forholdsregler ved brug af ultrafiltreringsrør
(1) Vælg det relevante ultrafiltreringsrør. Generelt bør molekylvægten, der skal bevares, ikke være større end 1 / 3 af molekylvægten af målproteinet. For eksempel, hvis molekylvægten af målproteinet er 35kDa, kan ultrafiltreringsrøret med 10kDa molekylvægt vælges. Hvis molekylvægten af målproteinet er ca. 10kd, kan der anvendes et ultrafiltreringsrør med en molekylvægt på 3KD. Læs omhyggeligt brugsanvisningen og vær opmærksom på den forskellige tolerance for ultrafiltreringsmembran over for forskellige kemikalier.
(2) Den nyindkøbte ultrafiltrering er tør. Tilsæt ultrarent vand før brug, og vandet passerer helt gennem membranen. Forkøl det i et isbad eller køleskab i et par minutter. Hæld derefter vandet ud og tilsæt proteinopløsningen. Den tilføjede mængde må ikke overstige den hvide linje på toppen af røret. Operationen skal være lys. Før der tilsættes proteinopløsning, skal ultrafiltreringsrøret indsættes på is til forkøling.
(3) Balance. Både masse og tyngdepunkt skal afbalanceres. Bemærk, at hastigheden og accelerationen ikke skal være for hurtig, ellers vil ultrafiltreringsmembranen blive direkte beskadiget. Start centrifugal ultrafiltrering (centrifugeforkøling til 4 grader). Efter at omdrejningstallet for forskellige centrifuger er omdannet til G, er det anderledes. Juster centrifugens acceleration til det laveste gear for at reducere trykket på membranen. Bemærk, at du skal vente, indtil centrifugen når målhastigheden, før du forlader centrifugen, ellers når der er et problem med centrifugen, kan du ikke håndtere det første gang. Membranens og den roterende aksels retning skal justeres i overensstemmelse med instruktionerne (i tilfælde af vinkelroterende centrifuge er membranen vinkelret på akslen). I praktisk brug er hastigheden generelt lavere end i manualen, hvilket kan forlænge centrifugalrørets levetid.
(4) Når det er koncentreret til de resterende 1 ml, tages 50ul bufferopløsning og tilsættes 10ul for at strømme igennem for at se, om det bliver blåt, for at bedømme, om ultrafiltreringsrøret lækker protein. Hvis røret lækker, hæld det øverste lag og flyd gennem det nye rør og start ultrafiltrering. For nøjagtigt at bedømme, om røret lækker, centrifugeres med 5 mgml BSA i 10 minutter, derefter tage strømning igennem, køre proteinlim eller Bradford til grov måling og fortsætte med at tilføje den resterende proteinopløsning til koncentration (fungere på is for at forhindre proteinet i at blive opvarmet), indtil alle de koncentrerede opløsninger tilsættes. Vær opmærksom på, om proteinudfældning forekommer under centrifugering, hvilket resulterer i rørblokering. Hvis nedbør forekommer, skal du bestemme den specifikke årsag til nedbør, om proteinkoncentrationen er for høj, eller bufferen er uhensigtsmæssig; Førstnævnte kan løses ved samtidig ultrafiltrering med flere ultrafiltreringsrør for at reducere koncentrationen. Sidstnævnte er at ændre forskellige bufferopløsninger, indtil proteinet ikke udfældes.
(5) De foregående trin anvendes til at koncentrere protein. Hvis du vil ændre bufferen, når den samlede proteinopløsning er koncentreret til ca. 1 ml, skal du forsigtigt tilføje en ny buffer (ultrafiltrering gennem 0,22um ultrafiltreringsmembran) og derefter koncentrere til ca. 1 ml i tre på hinanden følgende gange. Det endelige volumen af den sidste koncentration afhænger af den krævede proteinkoncentration, som generelt ikke er mere end 500ul, eller den kan koncentreres til mindre end 200ul. Ifølge volumenkoncentrationen på mindst 10 gange hver gang kan den nå mere end 1000 gange tre gange, hvilket dybest set kan opnå formålet med at ændre bufferen.
