Kort diskussion af flere unikke metoder til hule fibre i inklusion Bod-rensning

Inclusion Bodies (IB) er højdensitet, uopløselige proteinpartikler pakket ind i membraner dannet, når fremmede gener udtrykkes i prokaryote celler, især i Escherichia coli. Når det observeres under et mikroskop, er IB et område med høj refraktion, som tydeligvis er forskelligt fra andre komponenter i cytoplasmaet.

Inklusionslegemedannelse er relativt kompleks, relateret til hastigheden af ​​proteinproduktion i cytoplasmaet, koncentrationen af ​​nyligt genererede peptider er høj, og der er ikke tid nok til at folde, så der dannes amorfe proteinaggregater. Inklusionslegemerne er grundlæggende sammensat af proteiner, hvoraf mere end 50% er klonede produkter. Den primære struktur af disse produkter er fuldstændig korrekt, men den tredimensionelle konfiguration er forkert, så der er ingen biologisk aktivitet. Inklusionslegemets størrelse er 0,5-1μm, uopløseligt i vand, kun opløseligt i denatureringsmidler såsom urinstof, guanidinhydrochlorid osv.

I E. coli kan inklusionslegemer forekomme to steder i cellen: cytoplasma og perifert cytoplasma. Placeringen og karakteristika af inklusionslegemer i cellen afhænger af, hvordan proteiner udtrykkes.

Indeslutningerne i cytoplasmaet af E. coli varierer generelt i diameter fra {{0}},2 til 1,5μm, og forskellige proteiner har forskellige diametre, såsom størrelsen af ​​interferon er 0,811μm, og størrelsen af prorennet er 1.281μm. I nogle tilfælde er diameteren af ​​nogle inklusionslegemer større end diameteren af ​​E. coli, hvilket giver E. coli et fremspring. Generelt har en celle kun ét inklusionslegeme.

 

Oprensning af inklusionslegeme

 

Oprensningsprocessen for inklusionslegemet er generelt:

Celleknusning:

Den generelle teknologi til celleknusning er: højhastighedsknusning af væv, homogenisering af glashomogenisator, ultralydsbehandling, gentagen fryse-tø-metode, kemisk behandling (generelt ved hjælp af lysozymbehandling).

 

Inklusive kropsvask:

Inklusionslegemer er inaktive faste partikler dannet ved intracellulær agglutination af proteiner udtrykt af bakterier, som normalt eksisterer i amorf, uopløselig form. I inklusionslegemet udgør det sande målprotein kun omkring 50 %, og resten indeholder lipider, lipopolysaccharider, nukleinsyrer og heteroproteiner, som er bundet til inklusionslegemet og påvirker renatureringen af ​​inklusionslegemets protein. Derfor er vask før denaturering et meget nødvendigt trin.

Derudover er vask af inklusionslegemer nyttig til at øge genfoldningsudbyttet af rekombinante proteiner. Ved at fjerne urenheder kan forhindringer i renatureringsprocessen reduceres, så proteinet mere effektivt kan foldes og samles korrekt og derved forbedre proteinets aktivitet og funktion‌.

Vask almindeligvis brugt mindre end 1 % af det neutrale vaskemiddel, såsom Tween, Triton, Urea og NP40 plus EDTA og reduktionsmidler 2-mercaptotreitol (DTT), -mercaptoethanol gentaget mange gange, fordi vaskemidlets vaskekapacitet er forbedret med stigningen af ​​opløsningens ionstyrke, ved vask af inklusionslegemer kan tilsættes NaCl for at øge ionstyrken.

Inklusionslegemer kan anvendes til at fjerne andre komponenter i celledbrydningsopløsningen ved centrifugering eller filtrering, som begge drager fordel af forskellige fysiske egenskaber ved inklusionslegemer.

 

Centrifugering:

Inklusionslegemeproteiner er meget tættere end det samme volumen af ​​cellefragmenter, så inklusionslegemet kan adskilles fra resten af ​​cellen ved hjælp af centrifugering. Kontinuerlig centrifugering er den hyppigst anvendte operation til opnåelse af inklusionslegemer i industriel produktion. Da tætheden af ​​cellefragmenterne er mindre end den for inklusionslegemet, er sedimentationshastigheden mindre end inklusionslegemets. Kontinuerlig suspension og centrifugering kan centrifugere det meste af inklusionslegemet, mens cellefragmenterne gradvist fjernes.
Filtrering (tangential flow filtration) : På grund af de forskellige molekylstørrelser af inklusionslegemer og opløselige proteiner kan filtreringsmetoden anvendes, hvilket kan reducere driftsomkostningerne og gøre det nemt at skalere op. Tangential flow filtration (TFF) drives af den transmembrane trykforskel. Stoffer og urenheder, der er mindre end membranens porestørrelse, passerer gennem membranen, mens urenheder såsom celler med større partikler fanges. Membranåbningen, der generelt bruges til filtreringsvask, er 0,1 μm. Hulfiber tangentiel flow mikrofiltrering kan direkte håndtere højt faststofindhold af flydende materiale, færre trin, enkel betjening, membranen kan bruges gentagne gange gennem rengøring, reducere udstyrsinvesteringer og driftsomkostninger i overensstemmelse med kravene til modulær automatiseret produktion.

 

Det følgende er en ansøgningssag til vask af inklusionslegeme ved hjælp af Guidling hulfibersøjler.

Vi brugte 94 cm2 0.1-0.45μm hulfiber til at koncentrere 250mL væske (målproteinmolekylvægt 17kd). I hele vaskeprocessen blev genvindingshastigheden for målprotein og membranfluxudtømning undersøgt.

0-71min er koncentrationsprocessen, 71-224min er vaske- og filtreringsprocessen. Under hele mikrofiltreringsprocessen steg TMP gradvist, væskeindløbshastigheden forblev uændret, og den gennemsnitlige materialeflux var 12LMH.

Resultaterne viste, at målproteinet var fuldstændigt fanget, og genvindingsgraden for målprotein var mere end 90 %. Ledende hulfibersøjler er stabile og velegnede til denne applikation.

 

Inklusionslegemeopløsning:

Inklusionslegemer opløses generelt under betingelse af denatureringsmiddel urinstof eller guanidinhydrochlorid, og de opløste inklusionslegemeproteiner er fuldstændigt denaturerede, det vil sige, bortset fra at den primære struktur og kovalente bindinger bevares, alle hydrogenbindinger og hydrofobe bindinger ødelægges og hydrofobe sidekæder er helt udsatte.

Urinstof og guanidinhydrochlorid er middelstyrke denatureringsmidler, som let fjernes ved dialyse og ultrafiltrering. Den generelle koncentration af urinstof 8-10M, guanidinhydrochlorid 6-8M. Urinstofopløsning har fordelene ved ikke-ionisering, neutral, lav pris, fjernelse af protein efter renaturering vil ikke forårsage en stor mængde proteinudfældning, og opløste inklusionslegemer kan oprenses ved en række kromatografiske metoder, så det har været meget brugt .

 

Refoldning af kropsprotein-genfoldning:

Det opløste rekombinante protein skal foldes korrekt for at danne et funktionelt protein. Teknikker til renaturering omfatter fortynding af proteinopløsning til næsten neutral, fjernelse af denatureringsmiddel, renaturering på søjle og gelfiltreringskromatografi. Blandt dem er fortynding af proteinopløsning til næsten neutral og fjernelse af denatureringsmiddel en almindelig klassisk metode til renaturering, især fortyndingsrenatureringsmetode har den højeste udnyttelsesgrad.

Fjernelse af denatureringsmiddel:

Dialyse: Fordelen er, at volumen ikke øges, og fjernelseshastigheden af ​​denatureringsmiddel styres ved gradvist at reducere koncentrationen af ​​ekstern permeabel væske, men det tager lang tid og er let at danne inaktive proteinaggregater, som ikke er egnet til stordrift og kan ikke anvendes på produktionsskalaen.

Ultrafiltrering (TFF): let at kontrollere dialysehastigheden, uanset om det er i forskning og udvikling, pilottest eller produktion, kan fjerne denaturanter (væskeændring + koncentration) gennem ultrafiltrering (TFF).

 

Inklusionslegemeproteinrensning:

Metoderne til proteinoprensning efter renaturering svarer til metoderne til oprensning af opløseligt protein, nemlig ionbytterkromatografi, gelfiltreringskromatografi, affinitetskromatografi, ammoniumsulfatudsaltudfældning osv.

Inklusionslegemer har ingen biologisk aktivitet, der er ingen grund til at bekymre sig om tab af proteinaktivitet, og store mængder af ekspression vil ikke føre til celledød og maksimere resistens mod proteaseangreb. Jiuling hule fibre kan anvendes fleksibelt i nedstrøms rensningsprocessen af ​​inklusionslegemer. I inklusionslegemets vasketrin, fremragende ydeevne sammenlignet med centrifugalvaskning, kan brugen af ​​ni aldersteknologi mikrofiltreringshulfiber til tangentiel flowfiltreringsvask i høj grad forkorte procestiden, og den generelle genvindingshastighed kan nå mere end 90%. Jiuling hule fibre kan også anvendes i proteinrenatureringstrinnet i inklusionslegemer. Turbiditeten af ​​den fødevæske, der filtreres ved hjælp af hule mikrofiltreringsfibre, vil blive væsentligt reduceret, og proteingenvindingshastigheden er høj; Brugen af ​​hule ultrafiltreringsfibre kan ikke kun fjerne denatureringsmidler, men også forkorte den kromatografiske prøveindlæsningstid for at spare tid, reducere mængden af ​​fyldstof og reducere produktionsomkostningerne. Genvindingsgraden for mikrofiltrerings-/ultrafiltreringshulfibre varierer med forskellige materialer, og den generelle genvindingsgrad kan nå op på 90-95%.

Guidling Technology byder dig velkommen til at anmode om testsæt til relaterede anmeldelser.

 

Om Guidling

Guidling Technology er en national højteknologisk virksomhed med fokus på biofarmaceutiske produkter, cellekultur, oprensning og koncentration af biomedicin, diagnose og industrielle væsker. Vi har med succes udviklet centrifugalfilterenheder, ultrafiltrerings- og mikrofiltreringskassetter, virusfilter, TFF-system, dybdefilter, hule fibre osv., som fuldt ud opfylder anvendelsesscenarierne for biofarmaceutika, cellekultur og så videre. Vores membraner og membranfiltre bruges i vid udstrækning til koncentrering, ekstraktion og adskillelse af forfiltrering, mikrofiltrering, ultrafiltrering og nanofiltrering. Vores mange produktlinjer, fra små laboratoriefiltrering til engangsbrug til produktionsfiltreringssystemer, sterilitetstestning, fermentering, cellekultur og mere, opfylder behovene for test og produktion. Guidling Technology ser frem til at samarbejde med dig!